多位點序列分型MultilocusSequencingTypingMLST,1,Contents,兩種分型方法的比較,MLST的步驟,MLST的方案設(shè)計,MLST的由來,實例分析,2,多位點酶電泳（Multilocusenzymeelectrophoresis,MLEE）,根據(jù)酶的電泳遷移率的不同來描述變異,3,MLEE的缺點,不能推斷特殊位點的堿基序列不同實驗室間的分型結(jié)果不能進行比較,4,MLST的首次使用,MLST是由多位點酶電泳(MLEE)衍生出來的一種分型方法在1998年,Maiden等首次將MLST應(yīng)用于腦膜炎奈瑟菌分型,5,多位點序列分型（MLST）,一種基于核酸序列測定的細菌分型方法通過PCR擴增多個管家基因內(nèi)部片段測定其序列，分析菌株的變異,6,MLST的原理,MLST方法一般測定610個管家基因內(nèi)部400600bp的核苷酸序列，每個位點的序列根據(jù)其發(fā)現(xiàn)的時間順序賦予一個等位基因編號，每一株菌的等位基因編號按照指定的順序排列就是它的等位基因譜，也即是這株菌的序列型（sequencetype,ST）。這樣得到的每個ST均代表一組單獨的核苷酸序列信息。,7,序列型（ST）,序列型（Sequence-typying,STs）等同于MLEE得出的電泳型(Electrophoretictype,ET）通過比較ST可以發(fā)現(xiàn)菌株的相關(guān)性,即密切相關(guān)菌株具有相同的ST或僅有極個別基因位點不同的ST,而不相關(guān)菌株的ST至少有3個或3個以上基因位點不同,8,MLST分析方法,MLST技術(shù)針對看家基因設(shè)計引物對其進行PCR擴增和測序,得出每個菌株各個位點的等位基因數(shù)值,然后進行等位基因圖譜(allelicprofile)或序列類型(sequencetypes,STs)鑒定，再根據(jù)等位基因圖譜使用配對差異矩陣(matrixpair-wisedifferences)等方法構(gòu)建系統(tǒng)樹圖進行聚類分析。,9,MLST方案的設(shè)計,三要素：選擇經(jīng)過初步篩選的菌株選擇具有獨特特征的基因位點設(shè)計用于基因擴增和序列測定的引物,10,1.菌株的選擇,根據(jù)已有的分型方法和流行病學(xué)資料，選擇100株左右具有代表性的菌株作為分析對象。理論上，這些選定的菌株要代表所研究細菌的群體，而不是僅僅包含那些對人致病的克隆。收集的菌株最好具有代表性，不僅僅由一個亞型組成。,11,2.管家基因的確定,全基因組序列的測定大大方便MLST位點的選擇一般選擇10到20株菌評價10至15個備選位點。最終采用7個位點進行后續(xù)實驗和分析。如果需要提高分辨力，可以加入個別非保守的基因，例如表面抗原基因或者毒力基因，這樣比增加管家基因的個數(shù)將更有效,12,3.引物的設(shè)計,目的片段長度：400600bp所有引物調(diào)整為同一退火溫度，以適用于大范圍流行病學(xué)監(jiān)測和群體研究為了發(fā)現(xiàn)引物結(jié)合位點可能存在的變異，每個位點都應(yīng)該設(shè)計一對以上引物,13,/,實際運用中，對于已有的成熟MLST方案的細菌，可直接從MLST數(shù)據(jù)庫中獲取方案。/,14,15,16,17,MLST的步驟（二）核酸序列信息的獲取,18,MLST的步驟（三）結(jié)果分析,19,結(jié)果分析,根據(jù)分析的細菌群體組成1.以等位基因編號和ST編號為基本分析單位提交到MLST分析網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（）START和eBURST2.直接分析核苷酸序列上傳到GenBank比對服務(wù)器進行BLAST比對驗證,20,數(shù)據(jù)分析得到等位基因圖譜,新的STs則找出對應(yīng)的clonalcomplex,在數(shù)據(jù)庫中找出相應(yīng)的STs,群體進化研究,分子流行病學(xué)研究,菌群結(jié)構(gòu)調(diào)查,菌群遺傳學(xué)分析,疾病的全球性監(jiān)控,鑒定暴發(fā)性疾病的病原體,MLST結(jié)果分析流程圖,21,ST和克隆型,遺傳學(xué)上具有相關(guān)性但并不相同的細菌的集合,被稱為是同源復(fù)合體(Theclonalcomplex),也叫克隆型。以其核心的基因型來命名。,22,MLST和PFGE的比較兩種不同的分子分型技術(shù),23,不同分子分型方法比較,24,MLST和PFGE的比較兩種不同的分子分型技術(shù),脈沖場凝膠電泳（PFGE）,比較所確定的高度變異片段高分辨力不適于進行全面的流行病學(xué)調(diào)查及生物進化分析不同實驗間重復(fù)性較差標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)數(shù)據(jù)庫,多位點序列分型（MLST）,比較進化較慢的位點標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)數(shù)據(jù)庫不同實驗室間重復(fù)性好不適用于同血清型菌株間比較,25,MLST實例分析,26,1.MLST方案（同MLSTDatabase）,27,2.核酸序列信息的獲取,2.1樣本來源54株結(jié)腸彎曲菌(C.coli)分離于2002年零售禽肉中，均為不重復(fù)菌株2.2PCR擴增2.3測序,28,3