16 川省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn) 1/T 1203 2011 馬鈴薯 M 病毒、馬鈴薯 S 病毒檢疫鑒定技術(shù)規(guī)程 2011 - 01布 2011 - 03施 四川省質(zhì)量 技術(shù) 監(jiān)督局 發(fā)布 2011 I 目 次 前言 . 范圍 . 1 2 規(guī)范性引用文件 . 1 3 術(shù)語和定義 . 1 4 原理 . 1 5 試劑與材料 . 1 6 儀器 及用具 . 3 7 取樣 . 3 8 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn) . 3 9 結(jié)果判定 . 4 10 樣品保存 . 4 附錄 A（資料性附錄） 馬鈴薯 M 病毒、馬鈴薯 S 病毒基本信息 . 5 附錄 B（資料性附錄） 馬鈴薯 M 病毒 驗(yàn)程序 . 6 附錄 C（資料性附錄） 馬鈴薯 S 病毒 驗(yàn)程序 . 8 附錄 D（資料性附錄） 馬鈴薯 M 病毒 驗(yàn)程序 . 10 附錄 E（資料性附錄） 馬鈴薯 S 病毒 驗(yàn)程序 . 12 2011 言 本標(biāo)準(zhǔn)分為范圍、 規(guī)范性引用文件 、 術(shù)語和定義、原理、試劑與材料、儀器及用具、取樣、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)、結(jié)果判斷、樣品保存等部分。 本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：四川省農(nóng)業(yè)廳植物檢疫站 。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人： 寧紅、萬佳、劉可、郭迪金、吳志平、黃玲、李耄 1203 2011 I 馬鈴薯 M 病毒、馬鈴薯 S 病毒檢疫鑒定技術(shù)規(guī)程 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了馬鈴薯 見附錄 A） 、馬鈴薯 見附錄 A）的取樣、 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)、 結(jié)果判斷及樣品保存的 技術(shù) 要求 和方法 。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于馬鈴薯感染 馬鈴薯 鈴薯 檢驗(yàn)和鑒定。 2 規(guī)范性引用文件 下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 業(yè)植物調(diào)運(yùn)檢疫規(guī)程 868鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯 病毒檢驗(yàn)鑒定技術(shù)規(guī)程 3 術(shù)語和定義 下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 目標(biāo)條帶 據(jù)某種病毒 特異的堿基序列設(shè)計(jì)特異引物，通過 到的與引物設(shè)計(jì)長度吻合的 標(biāo)條帶的存在，是判斷某種病毒存在的標(biāo)準(zhǔn)。 本標(biāo)準(zhǔn)中 標(biāo)條帶 為 63035 注：改寫 868義 4 原理 兩種病毒 田間通過蚜蟲和農(nóng)事操作進(jìn)行傳播，遠(yuǎn)距離主要通過人為的引種、商品流通等 途徑 傳播，帶毒塊莖和種苗是該病毒 遠(yuǎn)距離 傳播的主要載體， 兩種病毒具有潛隱性， 根據(jù)病害癥狀很難確定馬鈴薯馬鈴薯 的 病毒種類， 薯塊上一般不表現(xiàn)癥狀。 采 用免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法，可快速根據(jù)有關(guān)判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行馬鈴薯 馬鈴薯 鑒定。 5 試劑與材料 除非另有說明，在本標(biāo)準(zhǔn)中僅使用確認(rèn)的分析純試劑和蒸餾水或去離子水或相當(dāng)純度的水。 疫學(xué)檢驗(yàn)試劑 捉抗體（ 鈴薯 M 病毒免疫球蛋白，抗體稀釋度按市售產(chǎn)品要求進(jìn)行。貯藏于 4 條件下備用。 1203 2011 鈴薯 S 病毒免疫球蛋白，抗體稀釋度按市售產(chǎn)品要求進(jìn)行。貯藏于 4 條件下備用。 標(biāo)抗體（ 堿性磷酸酶標(biāo)記的馬鈴 薯 M 病毒的免疫球蛋白抗體。按市售產(chǎn)品要求進(jìn)行稀釋，貯藏于4 條件下備用。 堿性磷酸酶標(biāo)記的馬鈴薯 S 病毒的免疫球蛋白抗體。按市售產(chǎn)品要求進(jìn)行稀釋，貯藏于4 條件下備用。 被緩沖液（ 取 g 碳酸氫鈉（ g 碳酸鈉（ 0.2 g 疊氮化鈉（ 用 1000 餾水溶解，并調(diào) 到 藏于 4 條件下備用。 滌液 (取 g 無水磷酸氫二鈉（ 0.2 g 氯化鉀（ 0.2 8.0 g 氯化鈉（ 0.5 g 吐溫 20 ，用 1000 餾水溶解，并調(diào)整 到 品提取液（ 取 1.3 g 無水硫酸鈉（ 20.0 g 聚乙烯吡咯烷酮（ 4 0.2 g 疊氮化鈉（ 2.0 g 級雞蛋清白蛋白粉、 20.0 g 吐溫 20，用 1000 滌液溶解，并調(diào)整 到 藏于 4 條件下備用。 標(biāo)抗體稀釋緩沖液（ 取 0.2 g 牛血清 白蛋白（或脫脂奶粉）、 2.0 g 聚乙烯吡咯烷酮（ n）、 g 疊氮化鈉（ 用 100 滌緩沖液溶解，并調(diào)整 到 藏于 4 條件下備用。 物緩沖液（ 用 80 菌蒸餾水將 g 氯化鎂（ g 疊氮化鈉（ 9.7 己醇胺 解后，用鹽酸調(diào) 到 容到 100 藏于 4 條件下備用。 物溶液（ 將 5硝基苯磷酸鹽（ 解于 5 物緩沖液中。底物溶液制備需在孵育結(jié)束前 15 ，避光條件下制備。 止液 12 g 氫氧化鈉（ 于 100 餾水。 驗(yàn)試劑 洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶 （ 100 U/l 。 沖液 40 20 2冰醋酸調(diào) 沖液（ 5x 50 100 0.1 10 50%甘油。 0 沖液 100 500 5 抑制劑（ 10 U/l 。 T 增強(qiáng)劑（ 水乙醇（ L 裂解液。 蛋白液。 。 0 洗液。 蒸水（ 氮 （ 物 1203 2011 游引物（ 基序列 : 5 - ，下游引物（ 基序列 : 5 ，用雙蒸水稀釋至 20M 。 游引物（ 基序列 : 5 - ，下游引物（ 基序列 : 5 - ，用雙蒸水稀釋至 20M 。 00NA 1500 酚藍(lán)（ 脂糖凝膠 稱取 1.5 g 瓊脂糖緩緩 倒 入 250 角瓶內(nèi)，加入 100 微波爐中加熱 1 解后，再加入 5 L 生物染料，倒入調(diào)平并安放適當(dāng)梳齒的制膠板上，冷凝后小心拔出梳齒。 6 儀器及用具 儀器及用具包括： 聚乙烯微量滴定板 根據(jù)樣品數(shù)量選用 40孔和 96孔兩種規(guī)格 ； 移液器 2 L 10 L、 10 L 50 L、 10 L 200 L、 200 L 1000 5 天平 1/100 g， 1/1000 g； 培養(yǎng)箱 ； 臺式高速離心機(jī) ； 酶聯(lián)免疫檢測儀 ； 水平電泳儀 ； 凝膠成像系統(tǒng) ； 研缽 內(nèi)徑 60 80 剪刀 ； 冰箱 ； 超低溫冰箱； 過濾柱 渦旋混勻器 。 7 取樣 株取樣 取樣方法按 868868 薯（塊莖）取樣 按 8 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn) 1203 2011 馬鈴薯 M 病毒 檢驗(yàn)方法 見 附錄 B。 如采用認(rèn)可的試劑盒，按說明操作。 鈴薯 S 病毒 檢驗(yàn)方法 見 附錄 C。 如采用認(rèn)可的試劑盒，按說明操作。 馬鈴薯 M 病毒 樣品的制備與檢驗(yàn) 方法見 附錄 D。 如采用認(rèn)可的試劑盒，按說明操作。 鈴薯 S 病毒 樣品的制備與檢驗(yàn) 方法見 附錄 E。 如采用認(rèn)可的試劑盒，按說明操作。 9 結(jié)果判定 陰性對照 陽性對照 性對照 倍的前提下， 樣品孔 倍 時(shí) ，判定為陽性反應(yīng)，即樣品帶 相應(yīng)的被檢病毒 ；否則判定為陰性 反應(yīng) ，即樣品不帶 相應(yīng)的被檢病毒 。 陰性對照無擴(kuò)增條帶，且陽性對照出現(xiàn) 630 前提下 ，樣品 30 定為陽性反應(yīng)，即樣品帶 否則判定為陰性 反應(yīng) ，即樣品不帶 在 陰性對照無擴(kuò)增條帶，且陽性對照出現(xiàn) 435 前提下 ，樣品 35 定為陽性反應(yīng)，即樣品帶 否則判定為陰性 反應(yīng) ，即樣品不帶 10 樣品保存 經(jīng)檢疫鑒定后的樣品，應(yīng)在 保存三個月，以備復(fù)驗(yàn)、談判和仲裁，保存 期滿后，需進(jìn)行滅活處理。 1203 2011 V A A 附 錄 A （資料性附錄） 馬鈴薯 M 病毒、馬鈴薯 S 病毒基本信息 類 鈴薯 簡稱 香石竹潛隱病毒屬 。 病毒粒體微曲線狀，大小 650 12死溫度 65 71，稀釋限點(diǎn) 100 1000倍， 20體外存活期幾天。引起馬鈴薯小葉病。 鈴薯 簡稱 香石竹潛隱病毒屬 。病毒粒體線形，長 650汁液稀釋限點(diǎn) 1 10倍，鈍化溫度 5560 ，體外存活期 3 4天 。 在馬鈴薯上引起輕度皺縮花葉或不顯癥 ， 其寄主 范圍較窄，系統(tǒng)侵染的植物僅限于茄科的少數(shù)植 物 害 鈴薯 害 癥狀 馬鈴薯 要侵染茄科，還可侵染藜科和豆科植物。 鈴薯幼苗期小葉片表面有油脂狀光澤，同時(shí)小葉迅速開始向下卷曲，葉背出現(xiàn)條斑壞死；隨著馬鈴薯生長發(fā)育，產(chǎn)生明顯花葉，葉片嚴(yán)重變形，并很快黃化至干枯；病株嚴(yán)重萎縮和矮化，其株高只相當(dāng)于健株的 1/3高度。 引起病株小葉脈間花葉、 畸形和頂葉卷曲 。 植株受 度在 24 以上，病癥隱蔽。該病毒是馬鈴薯上常見的病害，可引起較大的產(chǎn) 量損失，在東歐引起的產(chǎn)量損失達(dá) 40%。 鈴薯 害 癥狀 馬鈴薯 常 不表現(xiàn)癥狀，可持續(xù)存在馬鈴薯薯塊中，并通過薯塊作遠(yuǎn)距離傳播。在田間該病毒傳播很快，傳播范圍廣，既可通過葉片接觸傳播，也可通過蚜蟲傳播，種植一季后感染率可高達(dá) 70%，可使馬鈴薯減產(chǎn) 10當(dāng)與馬鈴薯 減產(chǎn) 20 播途徑 兩種病毒 田間通過蚜蟲和農(nóng)事操作進(jìn)行傳播，遠(yuǎn)距離傳播主要通過人為的引種、商品流通等，帶毒塊莖和種苗是該病毒傳播的主要載體。 1203 2011 B 附 錄 B （資料性附錄） 馬鈴薯 M 病毒 驗(yàn)程序 被抗體 被 向 酶聯(lián)反應(yīng)板 每孔加入 100 將酶聯(lián)反應(yīng)板置于保濕容器中，室溫孵育 4 h 或 4 冰箱過夜。 板 向每個反應(yīng)孔中加入 200 速倒出，重復(fù) 2次。洗板完成后將酶聯(lián)板倒置于吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中殘留液體。 樣 品制備 將待測樣品剪碎，取 0.3 入 1 加入 2 余樣品于 冰箱保存?zhèn)洳?，在制樣時(shí)應(yīng)注意 防止 樣品的 交叉污染。 樣 用 移液器 將制備好的樣品加入酶聯(lián)反應(yīng)板孔內(nèi)，每個樣品三次重復(fù)，每孔 100L。 設(shè)置陽性對照、馬鈴薯健康組織研磨液陰性對照和包被緩沖液空白對 照 。加樣完成后將酶聯(lián)反應(yīng)板置于保濕容器中， 室溫孵育 2 冰箱 12 h。 板 在每個反應(yīng)孔加滿洗滌液，迅速倒出，再加滿洗滌液，靜置 3 復(fù) 3次。洗板完成后將酶聯(lián)板倒置于吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中殘留液體。 合酶標(biāo)抗體 酶標(biāo)抗體 向酶聯(lián)反應(yīng)板每孔加入 100 于保濕容器中 室溫孵育 2 h。 板 同 色 每孔加入 100 L 底物溶液。 25 避光孵育 30 60 陽性對照顯色。 1203 2011 止反應(yīng) 顯色后在每孔中加入 50 L 終止液。記錄檢 測 結(jié)果，存檔備查。 果 測定和 記錄 用酶聯(lián)檢測儀測定 并記錄 光密度值 （ 。 1203 2011 C 附 錄 C （資料性附錄） 馬鈴薯 S 病毒 驗(yàn)程序 被抗體 被 向 酶聯(lián)反應(yīng)板 每孔加入 100 將酶聯(lián)反應(yīng)板置于保濕容器中，室溫孵育 4 h 或 4 冰箱過夜。 板 向每個反應(yīng)孔中加入 200 速倒出，重復(fù) 2次。洗板完成后將酶聯(lián)板倒置于吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中殘留液體。 樣 品制備 將待測樣品剪碎，取 0.3 入 1 加入 2 余樣品于 冰箱保存?zhèn)洳?，在制樣時(shí)應(yīng)注意 防止 樣品的交叉污染。 樣 用微量進(jìn)樣器將制備好的樣品加入酶聯(lián)反應(yīng)板孔內(nèi)，每個樣品三次重復(fù)，每孔 100L。 設(shè)置陽性對照、馬鈴薯健康組織研磨液陰性對照和包被緩沖液空白對 照 。加樣完成后將酶聯(lián)反應(yīng)板置于保濕容器中，室溫孵育 2 冰箱 12 h。 板 在每個反應(yīng)孔加滿洗滌液，迅速倒出，再加滿洗滌液，靜置 3 復(fù) 3次。洗板完成后將酶聯(lián)板倒置于吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中殘留液體。 合酶標(biāo)抗體 酶標(biāo)抗體 向酶聯(lián)反應(yīng)板每孔加入 100 于保濕容器中室溫孵育 2 h。 板 同 色 每孔加入 100 L 底物溶液。 25 避光孵育 30 60 陽性對照顯色。 1203 2011 止反應(yīng) 顯色后在每孔中加入 50 L 終止液。記錄檢 測 結(jié)果，存檔備查。 果 測定和 記錄 用酶聯(lián) 檢測儀測定 并記錄 光密度值 （ 。 1203 2011 X D D 附 錄 D （資料性附錄） 馬鈴薯 M 病毒 驗(yàn)程序 采用 給出該試劑盒信息是為了方便標(biāo)準(zhǔn)使用者，如果等效產(chǎn)品具有相同效果，則可使用這些等效產(chǎn)品） 提取馬鈴薯卷葉病毒 取 50 100 塊需經(jīng)發(fā)芽后切取幼芽），在液氮中迅速研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移粉末至預(yù)冷的 1.5 入 500 用前按 入 20 L），渦旋劇烈震蕩 5 勻漿液轉(zhuǎn)移至 12000 心 2 5 心吸取上清液至無 離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀。緩慢加入上清 液 勻，得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入 12000 掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱 00 12000 廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱 00 W， 12000 廢液，將吸附柱放回收集管中，重復(fù)漂洗一次。漂洗完后，將吸附柱在 12000 去除殘余液體，并在室溫下放置片刻。將吸附柱放入一個新的 膜中央加入 50 L 100 溫放置 2 2000 到 轉(zhuǎn)錄 應(yīng)體系 表 鈴薯 M 病毒 應(yīng)體系 反應(yīng)物 模板 2 T RT 入量（ L） 1 序 反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?42 ， 50 94 ， 5 4 保存。 應(yīng)體系 表 應(yīng)體系 反應(yīng)物 101 P2 合酶 的 入量（ L ） 1 4 4 1203 2011 應(yīng)程序 反應(yīng)程 序?yàn)椋?94 3 94 30 59 30 72 30 30次循環(huán)； 72 10 4 保存。 增產(chǎn)物檢測 脂糖凝膠電泳 將制膠板同制好的瓊脂糖凝膠一并放入水平電泳槽，取 5 以及 2 L 100NA 入樣孔內(nèi)。電泳緩沖液 1 100 V，電泳 30 果觀察和記錄 電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，放入凝膠成像系統(tǒng)中，觀察 并記錄 1203 2011 E 附 錄 E （資料性附錄） 馬鈴薯 S 病毒 驗(yàn)程序 同 轉(zhuǎn)錄 應(yīng)體系 應(yīng)體系見表 表 鈴薯 S 病毒 應(yīng)體系 反應(yīng)