單基因遺傳病的研究方法與技術,已知致病基因突變分析,基因突變,基因突變,穩(wěn)定突變：傳遞中不改變原有的突變。動態(tài)突變：傳遞中不斷改變自己，多見于短重復序列的突變，在一代代傳遞中重復次數(shù)發(fā)生明顯變化。,三核苷酸重復突變,基因突變類型,點突變：只有一個或幾個核苷酸的改變，是突變中最多見的形式。突變的結果分為： 同義突變、錯義突變、無義突變、剪切突變等。堿基的插入和缺失：基因編碼序列中插入或丟失一個或幾個堿基，其結果是突變點下游堿基序列發(fā)生移碼，編碼氨基酸序列都發(fā)生改變，又稱移碼突變（frameshift mutation），并可在突變點下游提前出現(xiàn)終止密碼。,基因突變類型,框內突變（inframe mutation）：3個或是3的倍數(shù)的堿基缺失或插入導致的突變，使基因丟失或增加1個或幾個氨基酸。DNA大片段缺失或復制（large deletion or duplication)：幾百個bp至幾十個kb的堿基缺失或復制。,各種類型病理性突變的比例,無義突變和移碼突變： 60稀有的錯義突變： 20DNA大片段缺失或重復: 20,基因突變分析所用實驗材料,臨床樣本取材：外周血組織毛囊頰粘膜脫落細胞羊水細胞絨毛,實驗應用材料：DNARNAProtein,RNA 的優(yōu)點與缺點,優(yōu)點: 不包含內含子 RT-PCR 能夠檢測異常的剪切體缺點: 不易獲得 要求操作特別小心且快速以免降解目的基因可能不在獲得的材料組織中表達 導致RNA不穩(wěn)定的突變不能被檢測,聚合酶鏈式反應,分子雜交,基因突變分析常用技術,Southern印跡雜交,例如：脆X綜合征,若X染色體在Xq27.3處呈現(xiàn)細絲樣結構，且連接的末端形似隨體，這條染色體就被稱為脆性X染色體。主要臨床癥狀：智力低下、語言障礙、性格孤僻、伴有特殊面容長臉、方額、大耳朵、嘴大唇厚，青春期后可見明顯大于正常的睪丸。通貫掌、三叉點C缺如。,Xq27.3,前突變和全突變,正常 CGG 200,Southern雜交法診斷Fragile X,F: Fully expanded and methylatedNM: Methylated X do not cut with EclXIP: Unmethylated premutationN: X in normal male and active normal female,聚合酶鏈式反應（PCR）,聚合酶鏈式反應于1983年由美國Cetus公司的K.Mullis建立，并和定點突變的發(fā)明者M.Smith一起榮獲1993年度諾貝爾化學獎，為生命科學領域的研究開創(chuàng)了嶄新時代。,PCR反應的特點,特異性強 引物與模板結合的特異性及聚合酶的忠實性 靈敏度高 指數(shù)增長，從pg (10-12)可擴增至 mg (10-6)水平 簡便、快速 24 小時完成擴增對標本的純度要求低 DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板,DNA的體外復制包括3個步驟：變性（denaturation）:94 C 95 C 退火（annealing）: 40 C 70 C 延伸（extension）:72 C 3個步驟作為PCR的一個循環(huán)，每當完成一個循環(huán)，一個分子的模板被復制為二個，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長。,PCR反應原理和反應過程,d.NTPs,耐熱DNA聚合酶,引物,添加反應混合液及樣本,變性,退火,加入試管中,延伸,繼續(xù)延伸,循環(huán),第二個循環(huán)4個拷貝,第三個循環(huán)8個拷貝,第n個循環(huán)2n個拷貝,PCR反應體系,參與PCR反應的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和緩沖液等。,引物(Primers),引物決定PCR擴增產(chǎn)物的特異性和長度化學合成的寡核苷酸能與模板特異地結合引物決定產(chǎn)物的特異性和長度引物設計時必須遵循一些原則,設計引物的原則：,二條引物分別位于被擴增片段的兩端，與模板正負鏈序列互補長度為18 25個核苷酸二條引物之間避免形成引物二聚體引物的堿基組成應平衡引物的5端可被修飾（引入酶切位點、引入突變位點、生物素等標記）,DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶復制的保真性：Taq DNA聚合酶無3 5外切酶活性，因而無校正功能，在復制新鏈的過程中會發(fā)生堿基錯配。Taq DNA聚合酶在每次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000。,擴增失敗,試劑錯加或漏加 實驗中如發(fā)現(xiàn)對照樣本也擴增失敗，可用原試劑重復一次，以確定試劑是否錯加或漏加。試劑失效變性溫度偏低 有些DNA所含G、C堿基對豐富，當變性溫度偏低時，雙鏈DNA不能完全解鏈。退火溫度偏高,標本中DNA含量過高或雜質過多。降低加樣量拖尾可明顯改善。Taq酶加量過大或擴增循環(huán)數(shù)太多,拖尾,非特異條帶,退火溫度低,提高退火溫度。引物特異性不佳，切膠純化特異條帶Taq酶加量過大或擴增循環(huán)數(shù)太多,引物二聚體,引物量過多：降低引物濃度。引物設計問題操作問題：反應體系建立后，如在室溫放置時間過長，會引起擴增后的二聚體加重。,應用PCR相關技術進行基因突變分析的策略與方法,策略與方法,直接分析法：PCR片段大小分析：片段大小有明顯差異PCR-RFLP：有酶切位點PCR-測序：確定突變點堿基改變多重連接探針擴增（MLPA）：片段缺失與重復RT-PCR: 基因大，可取到新鮮材料，且基因在其中有表達間接分析法：PCR-STR連鎖分析：基因大；在已知致病基因編碼區(qū)未檢測到突變的家系,1. 脊髓小腦性共濟失調,脊髓小腦性共濟失調是遺傳性共濟失調的主要類型，包括SCA127。成年期發(fā)病、常染色體顯性遺傳及共濟失調等是本病的共同特征，并表現(xiàn)在連續(xù)數(shù)代中發(fā)病年齡提前和病情加重（遺傳早現(xiàn)）。 SCA3是我國最常見的脊髓小腦性共濟失調亞型，基因位于14q24.332，含4個外顯子。CAG突變位于4號外顯子，患者擴增拷貝數(shù)為6189，正常人為1241。,NC F1 F2 F3 F4 F5 PC M,應用PCR技術分析一遺傳性脊髓小腦性共濟失調（SCA)3型家系,NC:正常對照PC:陽性對照F:家系成員M:Marker結果：家系成員1、3、4有SCA3致病基因突變;家系成員2、5未檢測到突變,1,2,3,4,5,2. 脊肌萎縮癥,脊肌萎縮癥( Spinal Muscular Atrophy , SMA)系指一類由于下運動神經(jīng)元變性導致的進行性骨骼肌無力和萎縮的一組疾病 ,是兒童和少年常見的致死性常染色體隱性遺傳病之一 ,其隱性致病基因攜帶率在人群中為 1/ 401/ 50 ,發(fā)病率為1/60001/10000.,應用PCR-RFLP技術分析脊肌萎縮癥（SMA）致病基因SMN,PCR擴增SMN基因exon7,DraI酶切PCR產(chǎn)物.酶切N：正常人PCR產(chǎn)物被酶切為兩條帶酶切P：陽性對照PCR產(chǎn)物被酶切為一條短帶病人1：結果顯示SMN基因有突變病人2和3：結果顯示未有突變,3. 腓骨肌萎縮癥(CMT),CMT是一類周圍神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病 ,其遺傳方式可為常染色體顯性遺傳(AD ,占絕大多數(shù)) 、常染色體隱性遺傳(AR)及 X連鎖顯性遺傳(XD)依據(jù)病理和電生理特點分為兩型:脫髓鞘型 (CMT1 型) 和軸突型 (CMT2型). CMT1型約占 CMT總數(shù)的70%，70%以上CMT1由PMP22基因重復引起其中X連鎖顯性遺傳CMT致病基因為CX32，含有2個外顯子,MLPA分析PMP22基因重復突變,PCR-測序直接分析CX32基因來診斷X連鎖腓骨肌萎縮癥,4. 假肥大型肌營養(yǎng)不良癥,假肥大型肌營養(yǎng)不良 (DMD) 是一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X染色體連鎖的遺傳性疾病，在2500個活產(chǎn)男嬰中即有一個患者 致病基因DMD含有79個外顯子 DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占60%-70%,MLPA 技術簡介,MLPAMultiplex ligation-dependent probe amplification鏈接依賴型多探針擴增技術最早由荷蘭人Schouten JP (Schouten JP et al, 2002) 在原有PCR技術上發(fā)展出來,MLPA 技術原理,MLPA方法檢測DMD,5. 成人型多囊腎,是一種最常見的單基因遺傳性腎病，發(fā)病率約為1/1000其主要特征在雙腎形成進行性增長的多個液性囊腫，最終可引起腎衰竭 具有遺傳異質性，存在兩個主要的致病基因PKD1和PKD2,46,47,ADPKD分子遺傳基礎,PKD1基因結構的復雜性,PKD基因分析:,直接基因突變分析： 適于散發(fā)病例和小家系病例。具有結果判讀的不確定性連鎖分析: 適于分析在已知致病基因編碼區(qū)未檢測到突變的較大家系，不適于散發(fā)病例和小家系病例,49,PCR-測序分析,在PKD1外顯子編碼序列上發(fā)現(xiàn)無義突變，使突變堿基所在密碼子由CGA變?yōu)榻K止密碼子TGA。,連鎖分析結果,新致病基因的研究方法和技術,家系連鎖分析來定位: 適于分析較大的遺傳病家系，不適于散發(fā)病例和小家系病例 二代測序技術： 適于散發(fā)病例和小家系病例,研究對象不同，策略方法不同,連鎖分析與二代測序相結合加快新基因的發(fā)現(xiàn),ATGGTCTCACTGCAACCG,ATGGTCTCACTGTAACCG,定位克隆,利用被定位的基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。,連鎖分析,DNA STR,SNP,常見遺傳標記,PCR-STR連鎖分析,CA,CA,CA,Primer 1,Primer 2,CA,CA,CA,CA,CA,CA,CA,CA,CA,CA,CA,CA,CA,CA,CA,毛細管電泳分析PCR片段大小,分析,連鎖分析結果,均勻分布于23對染色體上的STR SNP芯片,通過全基因組掃描來定位基因,外顯子組測序,用二代測序技術尋找致病基因,全基因組測序,基因功能相關分子遺傳學研究方法, 隱性突變往往導致失去功能（loss of function） 顯性突變可導致獲得功能（gain of function）和失去功能 失去功能：單倍劑量不足（halpoinsufficency） 獲得功能：顯性負效應（dominant negtive）,隱性突變和顯性突變的致病機制,基因突變對基因功能的影響及發(fā)病機制研究,將目的基因cDNA克隆到合適載體 應用定點突變方法建立突變基因載體體外功能研究：應用分子生物學技術研究與正?；蛳啾韧蛔兓蛲蛔冇蟹窆δ懿町?。 細胞水平功能研究，突變基因轉然細胞內，順時轉染或建立細