1、常用分子生物學(xué)及軟件下載網(wǎng)址,http:/ http:/ http:/ /entrez/ http:/ DNAsis DNAstar Vector NT,余 興 龍,PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù),參考書,1.分子克隆-實(shí)驗(yàn)指南(第二版)，第14章 2.分子克隆-實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，第8章 3. PCR最新技術(shù)原理、方法及應(yīng)用。黃留玉主編，化學(xué)工業(yè)出版社，2005年 4.靶向新基因的分子克隆策略-理論與方法。張學(xué)敏主編。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,PCR技術(shù)的創(chuàng)建,Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適

2、當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。美國MIT教授、1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎得主 1985年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。(Mullis為美國PE-Cetus) 1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù) 1989年美國Science雜志列PCR 為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎,專利官司 1987年美國專利局專利授權(quán) 1989年，DuPont異議，大小公司對簿公堂，將決定誰將獲得諾貝爾獎。DuPont理由是，1971年P(guān)CR的雛形已由Khorana一系列文章

3、闡明，并公布于眾，應(yīng)當(dāng)是公共產(chǎn)權(quán)。斯坦福大學(xué)Kornberg（研究DNA聚合酶獲諾貝爾獎）也認(rèn)為，任何具備生物技術(shù)知識的人都可以從Khorana等的文章中推知如何操作PCR。 美國專利局駁回DuPont異議，地方法院判屬Cetus Cetus獲勝后馬上反訴，指出DuPont已侵犯另一項(xiàng)與PCR有關(guān)的專利并要求對方賠償以及不再銷售與PCR有關(guān)試劑和儀器,DNA的結(jié)構(gòu),5ATGGTCCGTAAATGCTGCATG 3 3TACCAGGCATTTACGACGTAC 5 方響性：5 3,DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu),Each time a cell divides into two daughter cells

4、, all the DNA molecule must be duplicated. Duplication of an old DNA molecule into two new DNA molecules is called Replication. During replication, the DNA helix is unraveled and its two strands are separated. An area known as the replication bubble forms and progresses along the molecule in both di

5、rection. Then each DNA strand serves as a template for the synthesis of a new complementary strand. Each daughter DNA molecule is an exact copy of its parent molecule, consisting of one old and one new DNA strand. Thus the replication is semi-conservative,DNA semi-conservative Replication,In humans,

6、 the replication occurs at a rate of about 50 nucleotides per second, in prokaryotes this rate may reach 500 nucleotides/second. However eukaryotes have multiple replication bubbles on the same parent DNA, while prokaryotes open a single bubble per DNA molecule,引物,引物,Mullis的構(gòu)思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,1983年,三篇

7、重要論文,The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction (Scientific American, 1990,262(4):56-61, 64-5 ) Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase (Science,1988,239(4839):487-91 ) Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction (Me

8、thods in Enzymology, 1987,155:335-50,什么是PCR,1個DNA分子擴(kuò)增30、35和40個循環(huán)后其分子數(shù)分別是1.07109 、3.441010和1.0991012,什么是PCR,1-3泳道分別是從1個，2個和5個細(xì)胞中擴(kuò)增的人類肌動蛋白cDNA，C泳道為陰性對照,在顯微鏡下分離單個細(xì)胞,什么是PCR,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)，即利用DNA聚合酶通過引物延伸DNA的某個特定的區(qū)域而進(jìn)行的重復(fù)雙向DNA合成。其過程共包括模板DNA變性、退火和延伸三個步驟。每一循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一個循環(huán)的模板, 這三步周而復(fù)始地

9、循環(huán)進(jìn)行使被擴(kuò)增的DNA片段的量呈指數(shù)級增加。這樣經(jīng)過的一定數(shù)量的循環(huán)后，可得到大量復(fù)制的特異性DNA片段。利用這一技術(shù)可以很容易將一段基因復(fù)制為原來的十億甚至一千億倍,什么是PCR,類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù),什么是PCR,1). 變性(Denaturation)：將DNA加熱變性，使雙鏈DNA加熱后變成單鏈DNA以便它與引物結(jié)合作為復(fù)制的模板。一般加

10、熱到9296使DNA變性，變性DNA所需要的時間決定于DNA的復(fù)雜性、反應(yīng)管的導(dǎo)熱性能、PCR儀的種類和反應(yīng)的體積。對于G十C含量高的DNA序列，加入甘油、DMSO、延長變性時間可以提高PCR產(chǎn)量。在多數(shù)情況下，94、30秒即可達(dá)到有效變性,PCR反應(yīng)的三個步驟,2).退火(Anneal)：Primers在一定的溫度下與變性模板DNA的互補(bǔ)序列配對結(jié)合。這一步的溫度從37到72都有，由引物的長度和堿基組成及與靶序列的同源性程度而定。引物以顯著大于靶序列的濃度存在，長度也短于靶序列，因而它們與互補(bǔ)序列的配對速度比靶序列重新配對成雙鏈的速度快幾個數(shù)量級,PCR反應(yīng)的三個步驟,3). 延伸(Exte

11、nsion)：在DNA聚合酶(e.g.Taq)的作用下以兩引物間的DNA片段為模板，以dNTP為反應(yīng)原料，按堿基配對原則與半保留復(fù)制原理，進(jìn)行引物的延長合成新的DNA 分子。這一步通常在72進(jìn)行，所需要時間主要由DNA產(chǎn)物的長度和聚合酶的催化速率決定,PCR反應(yīng)的三個步驟,PCR的要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)有五種引物、 模板、dNTP、DNA聚合酶和反應(yīng)緩沖液 .引物：是與擴(kuò)增DNA片段兩端序列互補(bǔ)的一對寡核苷酸片段。引物的使用濃度0.2uM0.5uM，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。 2. DNA模板(Template

12、): 模板可以為純化的基因組或質(zhì)粒DNA；由RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA；或未經(jīng)純化的粗制生物樣品，如細(xì)菌培養(yǎng)液、菌落或噬菌斑等,PCR的要素 3. DNA聚合酶：是一類耐熱的DNA聚合酶。至今應(yīng)用最多的是Taq DNA聚合酶。目前有多種類的酶供應(yīng)，如Vent,Pfu等。根據(jù)循環(huán)圈數(shù)、DNA片段擴(kuò)增長度，催化一總反應(yīng)體積為50ul的PCR反應(yīng)所需的酶量為1 2。濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則PCR產(chǎn)量減少。 4. 合成的原料dNTP：在PCR反應(yīng)中，dNTP的使用濃度一般為50200umol/L，4種dNTP的濃度相等( 等摩爾配制)。dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系。dN

13、TP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝， -20冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量,PCR的要素 5.反應(yīng)緩沖液：為Tris-HCl緩沖液，依不同的DNA聚合酶種類，pH值在7.5-9.0之間，含有Mg2+、K+等離子、BSA和Tween等去污劑。一般以10濃度提供。其中Mg2+的濃度對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低 DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)

14、產(chǎn)物減少。 dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。有些廠商提供的反應(yīng)緩沖液中不含Mg2+而單獨(dú)提供含Mg2+的溶液,94,55,37,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus,酶活性(,溫度(,40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù),72,94,55,PCR循環(huán),在PCR管中按如下PCR反應(yīng)體系配制反應(yīng)混合物： 10反應(yīng)緩沖液 10ul 4種dNTP混合物

15、各200umol/L 引物 各50200pmol 模板DNA 10010000個分子 加雙或三蒸水至 100ul 將PCR管置PCR儀上，按預(yù)先設(shè)計設(shè)置好各反應(yīng)參數(shù)。先加熱至9395作用25分鐘進(jìn)行預(yù)變性，一般94 2分鐘即可。然后乘熱加入12.0的DNA聚合酶，按設(shè)置好的程序運(yùn)行即可。反應(yīng)完畢，取5-10l以瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定,PCR操作過程,PCR引物設(shè)計正確與否是PCR反應(yīng)能否成功的關(guān)鍵因素。所選的引物序列將決定PCR產(chǎn)物的大小、擴(kuò)增區(qū)域、引物Tm值。好的引物設(shè)計可以避免非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，增加PCR產(chǎn)量，正確設(shè)計的引物得到的產(chǎn)物量可接近于反應(yīng)指數(shù)期的產(chǎn)理量論值，而引物設(shè)計不當(dāng)?shù)腜CR產(chǎn)量

16、將很少甚至沒有。 引物設(shè)計考慮的因素主要有兩個：PCR的特異性和擴(kuò)增效率。特異性是指發(fā)生錯誤引發(fā)的概率。特異性不好的引物會產(chǎn)生不想要的PCR產(chǎn)物，甚至沒有特異擴(kuò)增。引物效率是指在每一PCR循環(huán)中一對引物擴(kuò)增的產(chǎn)物與理論上成倍增長量的接近程度?？捎梅匠淌?Y =X(1 +E)n 來計算.Y代表PCR產(chǎn)物 ,X指起始模板核苷酸的量 ,n指反應(yīng)循環(huán)數(shù),雙鏈DNA分子變性后其溶液的紫外吸收作用增強(qiáng)，表現(xiàn)為OD260值升高。對雙鏈DNA進(jìn)行加熱變性時，當(dāng)溫度升高到一定高度時，DNA溶液在260nm處的吸光度突然明顯上升至最高值，隨后即使溫度繼續(xù)升高，吸光度也不再明顯變化。若以溫度對DNA溶液的紫外吸光率

17、作圖，得到的典型DNA變性曲線呈S型?？梢奃NA變性是在一個很窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的。通常將核酸加熱變性過程中，紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時的溫度稱為核酸的解鏈溫度，由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的融解相類似，又稱融解溫度(Tm,melting temperature)。在Tm時，核酸分子內(nèi)50%的雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞,DNA分子的融解溫度( Tm,引物Tm值的計算 (1) Tm=4(G+C)+2(A+T) (2) 堿基最鄰近法(the nearest neighbor method, Oligo軟件 ) 引物的退火溫度通常設(shè)為：Tm-5,PCR 引物設(shè)計,1. 引物的長度：一般為15-30 bp，常用的是

18、18-26 bp，特異性一般通過引物長度和退火溫度控制，每增加一個核苷酸，引物特異性提高4倍(？)。如果使用背景清楚的DNA的樣品為模板，如：質(zhì)粒、純化的cDNA和純化的病毒基因組等，由于非特異性引物模板結(jié)合的可能性大大降低，引物長度可以縮短。若模板背景復(fù)雜，則應(yīng)選用長度為2226 bp，甚至更長的的引物。但引物長，擴(kuò)增退火時效率降低，而使擴(kuò)增產(chǎn)物減少。經(jīng)驗(yàn)表明：使用Tm 值不低于54 /60 的最短引物，可獲得最好的效率和特異性。一對引物Tm不一致時，退火溫度就低不就高,引物設(shè)計原則,2、引物擴(kuò)增跨度： DNA檢測(如疾病診斷)以200-800bp為宜。其它依擴(kuò)增目的而定，特定條件下可擴(kuò)增長

19、至10kb的片段，最長者35kb。 3、引物堿基組成：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 但實(shí)際工作中應(yīng)靈活使用這一原則(如Oligo T,引物設(shè)計原則,4、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、回文結(jié)構(gòu)等二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 5、引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。若為aa編碼序列，避免最后一個堿基落在密碼子的第三位.避免3末端富含GC，最后三位避免3個連續(xù)的

20、G/C,最后一個以G或C為好，避免用A,引物設(shè)計原則,6、目的序列上并不存在的附加序列，如酶切位點(diǎn)和啟動子序列，可以加入到引物5端而不影響特異性。當(dāng)計算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應(yīng)該對其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。如附加序列為酶切位點(diǎn)，直接酶切克隆PCR產(chǎn)物時注意加酶切位點(diǎn)的保護(hù)性堿基。 7.引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯的同源性。進(jìn)行Blast分析可達(dá)此目的。 /BLAST,引物設(shè)計原則,8.簡并引物的設(shè)計：簡并引物是擴(kuò)增某一相同基因區(qū)域，堿基數(shù)目相同，但一些位置的堿基有異的引物混合物。不要在引物的3端使

21、用簡并堿基，因?yàn)?端最后3個堿基的退火足以在錯誤位點(diǎn)起始PCR。簡并引物用于根據(jù)蛋白質(zhì)序列擴(kuò)增其基因序列和序列保守性不高時的基因擴(kuò)增,引物設(shè)計原則,引物設(shè)計步驟,1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定靶標(biāo)DNA分子 2、從核酸數(shù)據(jù)庫中收集靶標(biāo)DNA分子的序列,序列高度保守者收集2-3個序列 (理論上高度保守者一個序列即可，但由于數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)并非100%正確，多收集1-2個進(jìn)行分析雖然增加了一點(diǎn)點(diǎn)麻煩，但能確保設(shè)計引物所依據(jù)序列的正確性)。若序列有變異則應(yīng)根據(jù)基因的變異情況將與靶標(biāo)DNA序列相關(guān)的代表性的序列盡可能的收集到. GenBank: /genbank/ EMB

22、L:srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin,引物設(shè)計步驟,3、以核酸分析軟件對序列進(jìn)行同源性、(單鏈 的)二級結(jié)構(gòu)等分析.DNAstar, DNAsis 4、計算機(jī)輔助設(shè)計. DNAstar, DNAsis,DNAman Vector NTI, Primer Designer ,Oligo 6.0 5、Blast分析:website /BLAST,1、保守性序列之基因檢測(診斷):可由計算機(jī)完成(示例：PCV-2) 2、非保守性序列之基因檢測(診斷)：進(jìn)行DNA的多重比較分析(同源性分析)后，找到序列的保守性區(qū)域，確定設(shè)計

23、引物的大致范圍，然后借助計算機(jī)輔助設(shè)計完成。(示例：CSFV、FMDV) 3、限定范圍的基因片段的擴(kuò)增：如目的基因的克隆、某些基因突變分析等。(示例：豬全長和成熟蛋白IL-6 cDNA的克隆,三種典型的引物設(shè)計類型,非特異性是指PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)非目的DNA分子的擴(kuò)增產(chǎn)物，甚至沒有目的DNA分子的擴(kuò)增。消除非特異性應(yīng)從以下7個方面考慮,提高PCR的特異性,1、引物設(shè)計 2、引物退火溫度 3、遞減PCR 4、引物濃度 5、熱啟動 6、鎂離子濃度 7、巢式PCR,一)合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒

24、定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。最好能劃分標(biāo)本處理區(qū);PCR反應(yīng)液制備區(qū);PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。 實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室各功能區(qū)用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA,PCR污染的消除(1,二) 實(shí)驗(yàn)用品及移液器應(yīng)專用。移液器污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染 (三)預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會。另外，PCR試劑

25、，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱,PCR污染的消除(2,四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。 (五)設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對照,PCR污染的消除(3,六)減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測水平就適可而止。 (七)選擇質(zhì)量好的PCR管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出,PCR污染的消除

26、(4,熱啟動PCR,引物與目的序列的結(jié)合是決定PCR反應(yīng)特異性的步驟。在較低的溫度下引物可能與模板發(fā)生錯配或是引物本身、引物對之間配對，盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72，但在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴(kuò)增而引起嚴(yán)重的非特異性擴(kuò)增。限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。 熱啟動PCR是通過抑制一種基本PCR反應(yīng)成分而延遲DNA合成，直

27、到PCR儀達(dá)到變性溫度。是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。在用于引物設(shè)計的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效,1、傳統(tǒng)方法：在溫度上升前，少加一種PCR反應(yīng)組份，多是先不加DNA聚合酶，也可以是dNTP或者引物，待溫度上升至退火溫度以上時再將成份補(bǔ)齊。 2、蠟丸介導(dǎo)法：將DNA聚合酶包裝于蠟丸中，溫度上升至80 后，蠟丸熔化。也有將Mg2+包裝入蠟丸中的。 AmpliWaxTM: PE 公司產(chǎn)品 Hotwax beads: Invitrogen公司產(chǎn)品,熱啟動PCR,3.

28、 應(yīng)用抗DNA聚合酶抗體：Taq StartTM單克隆抗體1994年由Clontech公司首先推出。低溫時抗體與酶結(jié)合，酶無活性，當(dāng)溫度上升至70 時抗體失活，酶活性恢復(fù)。如：Tth Start, Platinum Taq polymerase, Ampli Taq Gold 4. 酶修飾法：在DNA聚合酶的aa上用熱不穩(wěn)定化學(xué)基團(tuán)修飾，酶失活，當(dāng)在高溫作用一段時間后，修飾基團(tuán)失活，酶活性恢復(fù)。 如：Roache公司的Fast Start Taq 5. N-尿嘧啶糖基化酶介導(dǎo)法(UNG start): 在PCR反應(yīng)體系中加入少量的dUTP和UNG。在低溫時，非特異性產(chǎn)物中摻入dUTP，但可被U

29、NG降解。NUG在70 度時失活,熱啟動PCR,PCR產(chǎn)物的克隆,平端連接 通常情況下，PCR產(chǎn)物可直接與平端載體DNA進(jìn)行連接，但其連接效 率效低。因?yàn)門aqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性，能 在兩條DNA鏈的3末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產(chǎn)物成為 3突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3末端突出堿基將PCR產(chǎn)物變成平端DNA，然后再用平端連接法 克隆PCR產(chǎn)物,PCR產(chǎn)物的克隆,粘端連接 引物中設(shè)計入限制酶位點(diǎn)：由于PCR引物的5末端可以增加一些非 互補(bǔ)堿基，因此可以在兩引物的

30、5末端設(shè)計單限制酶或雙限制酶切 位點(diǎn)。這樣得到的PCR產(chǎn)物用限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與有互 補(bǔ)粘端的載體DNA重組。這種克隆方法效率較高，且當(dāng)兩引物中設(shè)計 不同酶切位點(diǎn)時，可有效地定向克隆PCR產(chǎn)物。其缺點(diǎn)是需要加長 PCR引物，除限制酶識別序列外，還需要在其5端多合成34個堿基 以利于限制性內(nèi)切酶與PCR產(chǎn)物末端的穩(wěn)定結(jié)合。即使如此，其酶切 效率也不夠高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等較為難切。采用突變 PCR方法可克服上述缺點(diǎn)。該方法是通過在兩PCR引物序列中改變1至 數(shù)個核苷酸創(chuàng)造出一個限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。鑒于PCR引物的3末端序 列的互補(bǔ)性是PCR成功的關(guān)鍵，在PCR引物的中

31、部或近5端改變1個或 幾個堿基對PCR擴(kuò)增效果影響不大。這種方法不需要增加PCR引物的 長度，而且酶切效果優(yōu)于5加端法,Tvector法 TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3末端加一個堿 基，所加堿基幾乎全是腺苷。據(jù)此，Marchuk等人采用3端突出一個 胸苷的質(zhì)粒DNA來克隆PCR產(chǎn)物，其克隆效率比平端的連接至少高出 100倍。他們用EcoRV將pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP 存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的兩個3末端各加一處胸 苷。因?yàn)樵?種dNTP都存在時，Taq聚合酶選擇性參入dATP，而當(dāng)僅 一種dNTP存在時，它只能參入該種

32、堿基。因此，在只加入ddTTP時， 用TaqDNA聚合酶可使平端載體DNA轉(zhuǎn)變成3末端突出一個胸苷的T尾 載體，稱為Tvector。用這種Tvectorsk可以較有效地直接克隆 PCR產(chǎn)物,PCR技術(shù)的種類及應(yīng)用,1 反向 PCR(Inverse PCR,IPCR)技術(shù) 反向PCR適用于擴(kuò)增已知序列的兩端的未知序列。其具體方法是選擇一個在已知序列中沒有，而在其兩側(cè)都存在的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶解后，將酶切的片段在連接酶的作用下環(huán)化，使得已知序列位于環(huán)狀分子上。根據(jù)已知序列的兩端序列設(shè)計兩個引物，以環(huán)狀分子為模板進(jìn)行PCR，就可以擴(kuò)增出已知序列兩側(cè)的未知序列,2 錨定 PCR(

33、Anchored PCR,APCR)技術(shù) 錨定PCR適合于擴(kuò)增那些只知道一端序列的目的DNA。例如，對于一端序列已知、一端序列未知的DNA片段，可以通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶給未知序列的那一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分別用多聚dC和已知的序列作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,3 不對稱 PCR(asymmetric PCR)技術(shù) 兩種引物濃度比例相差較大的 PCR技術(shù)稱不對稱PCR。在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同的引物濃度 ,常用 50 1 0 0 :1比例。在最初的1 0 1 5個循環(huán)中主要產(chǎn)物還是雙鏈 DNA,但當(dāng)?shù)蜐舛纫锉幌谋M后 ,高濃度引物介導(dǎo)的 PCR反應(yīng)就會產(chǎn)生大量單鏈 DNA。可制備單鏈 DNA片

34、段用于序列分析或核酸雜交的探針,4 反轉(zhuǎn)錄 PCR(reverse transcription,RT- PCR)技術(shù) 當(dāng)擴(kuò)增模板為 RNA時 ,需先通過反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為 c DNA才能進(jìn)行擴(kuò)增。RT- PCR應(yīng)用非常廣泛 ,無論是分子生物學(xué)還是臨床檢驗(yàn)等都經(jīng)常采用。保持RNA分子的完整性是RT-PCR能否成功的關(guān)鍵因素之一 RNA的提?。篢rizol試劑法 RT反應(yīng)：AMV, MLV PCR反應(yīng),5 修飾引物 PCR技術(shù) 為達(dá)到某些特殊應(yīng)用目的 ,如定向克隆、定點(diǎn)突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析等 ,可在引物的 5-端加上酶切位點(diǎn)、突變序列、轉(zhuǎn)錄啟動子及序列分析結(jié)合位點(diǎn)等,6 套(巢)式 PCR(

35、NEST PCR)技術(shù) 先用一對靶序列的外引物擴(kuò)增以提高模板量 ,然后再用一對內(nèi)引物擴(kuò)增以得到特異的 PCR帶 ,此為巢式 PCR。若用一條外引物作內(nèi)引物則稱之為半巢式 PCR。一般分兩步進(jìn)行。為減少巢式 PCR的操作步驟可將外引物設(shè)計得比內(nèi)引物退火溫度高些 , 在PCR反應(yīng)體系中將內(nèi)外引物同時加入(外引物用量小) 。首先 PCR時采用較高的退火溫度，只有外引物引發(fā)合成DNA。待外引物基本消耗盡時，降低退火溫度 ,內(nèi)引物開始引發(fā)DNA合成。這樣無需進(jìn)行二次PCR操作，不僅節(jié)約時間,同時也了降低了交叉污染的機(jī)會,7 等位基因特異性 PCR(Allele- specific PCR,ASPCR)技

36、術(shù) ASPCR依賴于引物 3-端的一個堿基錯配,不僅減少多聚酶的延伸效率 ,而且降低引物 -模板復(fù)合物的熱穩(wěn)定性。這樣有點(diǎn)突變的模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增后檢測不到擴(kuò)增產(chǎn)物 ,可用于檢測基因點(diǎn)突變,8 單鏈構(gòu)型多態(tài)性 PCR(single- strand conformational polymorphism PCR,SSCP-PCR)技術(shù) SSCP- PCR是一種簡單、高效地檢測DNA或RNA序列中點(diǎn)突變的技術(shù)，由于實(shí)驗(yàn)成本較低，也是一種目前較為常用的方法。 單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或少地影響其

37、空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同。因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開。,9、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(Random Amplification of Polymorphic DNA, RAPD） RAPD 技術(shù)是以隨機(jī)引物（一般為8-10bp）通過PCR反應(yīng)非定點(diǎn)擴(kuò)增DNA片段，然后用凝膠電泳分離擴(kuò)增片段，經(jīng)染色來顯示擴(kuò)增DNA片段的多態(tài)性。擴(kuò)增片段多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA 多態(tài)性。RAPD 所使用的引物量各不相同，但對任一特定引物，它在基因組DNA序列上有其特定的結(jié)合位點(diǎn)，一旦基因組

38、在這些區(qū)域發(fā)生DNA 片段插入、缺失或堿基突變，就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生變化，從而導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量和大小發(fā)生改變，表現(xiàn)出多態(tài)性。就單一引物而言，其只能檢測基因組特定區(qū)域的多態(tài)性，但利用一系列引物則可使檢測區(qū)域擴(kuò)大到整個基因組，因此，RAPD 可用于對整個基因組DNA 進(jìn)行多態(tài)性檢測，也可用于構(gòu)建基因組指紋圖譜。 RAPD標(biāo)記的一個明顯的特點(diǎn)是RAPD引物無特異性，可以用未知序列的基因組DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得一組不連續(xù)的DNA片段，且RAPD所需引物較短，10個左右的寡核苷酸即可。其次，一套引物可用于不同生物，建立一套標(biāo)準(zhǔn)引物，便可用于生物種內(nèi)多態(tài)性鑒定,RAPD是用單個

39、或單個以上的隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA，產(chǎn)生長度不等的片段，從而進(jìn)行多態(tài)性分析。它與特異性引物擴(kuò)增有幾個不同點(diǎn)： 特異性引物根據(jù)多態(tài)位點(diǎn)DNA序列設(shè)計，一般PCR成對使用各長20bP左右的引物，RAPD引物則完全隨機(jī)，長度不等，多為8-10bp，一般為單個使用，GC含量一般在50以上； 特異性引物擴(kuò)增退火溫度較高，堿基配對要求嚴(yán)格，RAPD退火溫度較低多為 35-36，允許適當(dāng)?shù)膲A基錯配，從而引發(fā)更多的擴(kuò)增子(Amplicon)，增加監(jiān)測多態(tài)性的能力。RAPD引物的序列完全隨機(jī)，幾乎可以用于任何生物而揭示其整個基因組的多態(tài)性，因此得到廣泛應(yīng)用,10、 隨機(jī)引物擴(kuò)增技術(shù) (arbitrary prime

40、d PCR,AP- PCR) AP- PCR技術(shù)通過隨意設(shè)計或選擇一個非特異性引物 ,在 PCR反應(yīng)體系中 ,首先在不嚴(yán)格條件下使引物與模板中許多序列通過錯配而復(fù)性 。如果在兩條單鏈上相距一定距離有反向復(fù)性引物存在 ,則可經(jīng) Taq酶的作用使引物延伸而發(fā)生 DNA片段的擴(kuò)增 ,經(jīng)一至數(shù)輪不嚴(yán)格條件下的 PCR循環(huán)后 ,再于嚴(yán)格條件下進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)DNA測序凝膠電泳分離后 ,經(jīng)放射性自顯影或熒光顯示即可得到 DNA指紋圖。AP-PCR用于腫瘤的抑制基因、癌基因的分離 ;菌種、菌株及不同物種的鑒定 ;遺傳作圖 ;不同分化程度或某些不同狀態(tài)下的組織的基因表達(dá)差異等方面的研究,SSR 又稱微衛(wèi)

41、星DNA，SSR 串聯(lián)重復(fù)的核心序列為 2-6bp, 其中最常見是雙核苷酸重復(fù)，即（CA）n 和（TG）n.其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。SSR 標(biāo)記的基本原理：根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補(bǔ)序列設(shè)計引物，通過PCR 反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，因而能夠用PCR 的方法擴(kuò)增出不同長度的DNA片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)分離片段的大小決定基因型，并計算等位基因發(fā)生頻率,11、簡單重復(fù)序列 Simple sequence repeats, SSR,12、擴(kuò)增性片段長度多態(tài)性 (Amplification Fragment Length Polymorphism

42、 , AFLP) AFLP技術(shù)是一項(xiàng)新的分子標(biāo)記技術(shù)，是基于PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點(diǎn)序列，作為引物結(jié)合位點(diǎn)。限制性片段用二種酶切割產(chǎn)生，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。它結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點(diǎn)，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性。由于AFLP擴(kuò)增可使某一品種出現(xiàn)特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過引物誘導(dǎo)及DNA擴(kuò)增后得到的DNA多態(tài)性可做為一種分子標(biāo)記。 AFLP可在一次單個反應(yīng)中檢測到大量的片段。以說AFLP技術(shù)是一種新的而且有很

43、大功能的DNA指紋技術(shù),13、聚合酶鏈反應(yīng)/限制性片段長度多態(tài)性分析法(PCR/RFLP)，目前有些研究者將PCR和RFLP結(jié)合起來對DNA進(jìn)行研究，即將DNA的特定序列用PCR方法擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物再用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切分析,14、 低嚴(yán)格單鏈特異性引物 PCR(Low-stringency single specific primer PCR,LSSP- PCR)技術(shù) LSSP- PCR是建立在 PCR基礎(chǔ)上的又一種新型基因突變檢測技術(shù) 。要求是“二高一低”,高濃度的單鏈引物 (5-端 / 3-端引物均可 ),約 4. 8mol,高濃度的 Taq酶,低退火溫度 (30 ),所用的模板必須是

44、純化的 DNA片段。在這種低嚴(yán)格條件下 ,引物與模板間發(fā)生不同程度的錯配 ,形成多種大小不同的擴(kuò)增產(chǎn)物 ,經(jīng)電泳分離后形成不同的帶型。對同一目的基因而言 ,所形成的帶型是固定的 ,因而稱之為“基因標(biāo)簽”。這是一種檢測基因突變或進(jìn)行遺傳鑒定的快速敏感方法,15 復(fù)合 PCR(multiplex PCR)技術(shù) 在同一反應(yīng)中用多對引物同時擴(kuò)增幾種基因片段 。復(fù)合PCR主要用于同一病原體的分型及同時檢測多種病原體、多個點(diǎn)突變的分子病的診斷。(示例：LT、ST Ve,distinguish wild-type (wt), heterozygous mutant (ht), and homozygous

45、mutant (hm) mice,例：鑒定E.coli毒素基因的多重PCR,例：鑒定E.coli毒素基因的多重PCR,E: 為EC0412A菌株不同菌 落的多重PCR M：DL2000 Marker,M：DL2000 Marker A: STa B: LT C: VT2e,例：鑒定E.coli毒素基因的多重PCR,A: ECH1 B: ECX4 C: ECX6 M: DL-200 marker D: ECXB3 E: ECXB5 F: ECXB8,中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報2005 第27卷 第2期,16 重組 PCR技術(shù) 重組 PCR技術(shù)是在兩個 PCR擴(kuò)增體系中 ,兩對引物分別由其中之一在其 5-端

46、和3-端引物上帶上一段互補(bǔ)的序列 ,混合兩種 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 ,經(jīng)變性和復(fù)性 ,兩組 PCR產(chǎn)物互補(bǔ)序列發(fā)生粘連 ,其中一條重組雜合鏈能在 PCR條件下發(fā)生聚合延伸反應(yīng) ,產(chǎn)生一個包含兩個不同基因的雜合基因。 示例：豬瘟病毒E2基因的定點(diǎn)突變、在大腸桿菌中的高效表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性.生物工程學(xué)報, 19:439-443,2003 MP1: ggAATTCATgCgCTTAgCCTgCAAggAAgATTACCgTTACgCAA TCTCATCAACCAATgAgATTgggTTACTCg MP2: TGCCAggTACCggCgACTGACCACATTAAGTGC MP3: AGTcGcc

47、GGTAccTGGCATCATTGCATAAGGG MP4: CGGAATTCAaATTGGGCAGACAAGGTAG,重組 PCR技術(shù),17、遞減PCR 遞減PCR通過在PCR的前幾個循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)在比估算的Tm高大約5的退火溫度下開始，然后每個循環(huán)降低1到2，直到退火溫度低于Tm 5。只有同同源性最高的目的模板會被擴(kuò)增。這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增，并會將擴(kuò)增的非特異性產(chǎn)物排擠出去。遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法較為有用，如AFLP DNA指紋分析,18、原位PCR技術(shù) 原位PCR就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原

48、位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項(xiàng)有較大潛力的新技術(shù). 原位PCR是Hasse等于1990年建立的，實(shí)驗(yàn)用的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細(xì)胞、血細(xì)胞等.其基本方法為固定組織或細(xì)胞:將組織細(xì)胞固定于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，再滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶.蛋白酶K消化處理:用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細(xì)胞片55消化處理2h后，962min以滅活蛋白酶K.PCR擴(kuò)增:在組織細(xì)胞片上，加PCR反應(yīng)液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴(kuò)增儀的金屬板上，進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增.有的基因擴(kuò)增儀帶有專門用于原位PCR的裝置.雜交:PCR擴(kuò)

49、增結(jié)束后，用標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交.顯微鏡觀察結(jié)果. 原位PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)歸有重大的實(shí)用價值.其特異性和敏感性高于一般的PCR,19、免疫-PCR 免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測系統(tǒng).它利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的極高靈敏性來檢測抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測. 免疫-PCR試驗(yàn)的主要步驟有三個:抗原-抗體反應(yīng)，與嵌合連接分子結(jié)合，PCR擴(kuò)增嵌合連接分子中的DNA(一般為質(zhì)粒DNA).該技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是嵌合連接分子的制備.

50、在免疫-PCR中，嵌合連接分子起著橋梁作用，它有兩個結(jié)合位點(diǎn)，一個與抗原抗體復(fù)合物中的抗體結(jié)合，一個與質(zhì)粒DNA結(jié)合，其基本原理與ELISA和免疫酶染色相似，不同之處在于其中的標(biāo)記物不是酶而是質(zhì)粒DNA，在操作反應(yīng)中形成抗原抗體-連接分子-DNA復(fù)合物，通過PCR擴(kuò)增DNA來判斷是否存在特異性抗原. 免疫PCR優(yōu)點(diǎn)為:特異性較強(qiáng)，因?yàn)樗⒃诳乖贵w特異性反應(yīng)的基礎(chǔ)上.敏感度高，PCR具有驚人的擴(kuò)增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于單個抗原的檢測.操作簡便，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒DNA比擴(kuò)增靶基因容易得多，一般實(shí)驗(yàn)室均能進(jìn)行,免疫學(xué)測定方法敏感性比較,20、突變體富集PCR法（mutant-enriched PCR） 用于從含量豐富的某一類基因中擴(kuò)增其中少量的突變DNA片段。如：ras基因家族某個密碼子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，如K-ras基因第12密碼子的BstNI位點(diǎn)，第