1、不同濃度地塞米松對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響:龐金輝，黃煌淵，張權(quán)，紀(jì)斌，曹成?！菊?目的觀察不同濃度地塞米松對體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞(hmscs)成骨分化、增殖能力及凋亡率的影響。方法 以梯度 密度分離法獲取人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，以1x1o9、1 x10-8> 1x107 1 x 10-6mol/l 4種不同濃度地塞米松分別處理細(xì) 胞。檢測各組細(xì)胞的堿性磷酸酶(alp)活性；rt pcr法檢測 骨橋蛋白(opn)基因的表達(dá)；四甲基偶氮"坐藍(lán)(mtt)比色法測定 各組細(xì)胞的增殖率；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。結(jié)果低濃度(ix 10-9mol/l)地塞米

2、松對alp的表達(dá)無顯著作用(p>0.05),而ix 10-smol/l及以上濃度的地塞米松可明顯增加alp的活性 (p<0.01)；所有實(shí)驗(yàn)組的hmscs均有opn mrna表達(dá)，其表達(dá) 強(qiáng)度隨著地塞米松濃度增加而增強(qiáng)；lx109mol/l地塞米松對細(xì)胞 增殖無明顯影響(p>0.05), lx10-8mol/l及以上濃度的地塞米松 可明顯抑制細(xì)胞的增殖(p<001)；體外培養(yǎng)的hmscs凋亡率隨地 塞米松濃度的增加而升高(p<0.01)o結(jié)論lx108mol/l及以上濃 度的地塞米松可顯著增強(qiáng)hmscs成骨分化能力，同時(shí)抑制

3、細(xì)胞增殖 并促進(jìn)其凋亡。【關(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細(xì)胞；地塞米松；堿性磷酸酶；骨橋蛋白；細(xì)胞增殖；凋亡abstract： objective to observe the effect of dexamethasone on the biological characteristics of human mesenchymal stem cells (hmscs) derived from bone marroary hmscs ethasone(l x 10-9,1 x 10-8,1 x 10-7 and 1 x 10-6mol/l). the alkaline phosphatase(alp) a

4、ctivity easured； mrna of osteopontin erase chain reaction(rt pcr);the proliferation of hmscs ined eter.results treatment of cells ethasone(l x 10-8,1 x 10-7 and 1 x 10-6mol/l) for 8 days led to a significant increase in alp activity(p<001) the osteopontin mrna ethasone respectively the optica

5、l density value of hmscs treated ethasone for 6 days ethasone increased the apoptosis rate of all hmscs cultured in vitro conclusion the high concentration of dexamethasone(l x 10-8,1 x 10-7 and 1x10- 6mol/l) induces the differentiation of hmscs to osteoblastic cells,inhibits the proliferation of ce

6、lls and leads to an increase of its apoptosis rate.key esenchymal stem cells； dexamethasone； alkaline phosphatase； osteopontin； cell proliferation； apoptosis骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells,hmscs)是近年來 骨組織工程和干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)種子細(xì)胞之一。目前已知，地塞米 松可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化，但是地塞米松 對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞影響的系統(tǒng)性研究較為鮮見。本文探討不同濃 度地塞米

7、松對體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化、增殖能力及 凋亡率等方面的作用，旨在更深入地了解地塞米松對hmscs生物學(xué) 特性的影響。材料與方法1主要試劑dmem培養(yǎng)基（hyclone公司）、地塞米松（sigma公司）、堿性 磷酸酶（alkaline phosphatase,alp ）定量檢測試劑盒（sigma公 司）、annexin v 凋亡檢測試劑盒（bender 公司）、trizol （sigma 公司）。2人hmscs的體外培養(yǎng)與觀察骨髓標(biāo)本均取自無血液疾病或骨病的成年人，事先征得所有獻(xiàn)髓者 的同意。將抽取的紅骨髓以磷酸緩沖液（phosphate buffered saline, pbs）稀

8、釋制成懸液，小心疊加至淋巴細(xì)胞分離液之上，離心，收 集呈云霧狀的有核細(xì)胞層，接種于10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)液 中，置于3丁c, 5%co2及飽和濕度條件下孵育定期換液，待細(xì)胞 生長至90%融合時(shí)，消化傳代。隨機(jī)抽取生長良好的細(xì)胞分5組：1 x10-9、1x10-8、1x1o7、1 x 10-6mol/l地塞米松組和不含地塞 米松的對照組，實(shí)驗(yàn)組分別稱為1x10-9、lx10-8> lx10-7> ix 10-6mol/l組。利用倒置相差顯微鏡逐日觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況。3四甲基偶氮卩坐藍(lán)（mtt）比色法測定hmscs的增殖率取hmscs以2000/孔接種于96孔板培養(yǎng)，隨機(jī)分組

9、后加入指定濃 度的地塞米松，對照組則不加地塞米松。6天后加無血清dmem培 養(yǎng)液100 ul, mtt 10u1,置37°c孵育4小時(shí)，加入十二烷基磺酸 鈉（sds） 100u1, 37°c放置2小吋，經(jīng)酶標(biāo)儀測定吸光度od。依 次測定各實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞的相對增殖率odmtt,每組測定14 孔。4alp活性的測定hmscs以2000/孔接種于96孔板培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的地 塞米松。培養(yǎng)8天后加入100u1二已胺醇，50u1 3mmol/l pnpp, 37°c孵育30分鐘，加入50 u 1 0.2 mmol/l naoh終止反應(yīng)，經(jīng)酶標(biāo) 儀405nm波長測

10、odalp值。每組樣本量為14孔，分別除以對應(yīng)的 odmtt均數(shù)，得出alp相對活性比值。5 hmscs凋亡率的檢測將hmscs以5 x 103/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，分組用地塞米松處 理，每組6皿細(xì)胞。地塞米松干預(yù)8天后，采用annexin v/pi雙染 色法對hmscs進(jìn)行凋亡率檢測。取沉淀細(xì)胞490 1u,先后加入 annexin v和pi工作液，暗處冰浴10分鐘上機(jī)檢測。每組樣本量為 6個(gè)，每個(gè)樣本至少檢測10000個(gè)細(xì)胞。6逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（rt pcr）法檢測細(xì)胞骨橋蛋白 （osteopontin, opn）基因表達(dá)6.1逆轉(zhuǎn)錄（rt）反應(yīng) 取hmscs,分組用不同濃度的地塞

11、米松干 預(yù)12天，trizol法抽提細(xì)胞總rna,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cdna。將 配制好的反應(yīng)混合物加滅菌純水至20 ul, 37°c水浴60分鐘，進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；97°c水浴5分鐘，然后迅速置于冰上。6.2聚合酶鏈反應(yīng)（pcr）擴(kuò)增引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù) 有限公司合成。opn引物的上游序列為:5* ctaggcatcacctgtgccatacc 3* , 下游 序 歹u :5*ctacttagactacttgaccagtgac 3* ,擴(kuò)增片段長度為 330bp。以0 actin作為內(nèi)參照,上游序列為:5 tgacggggtcacccacactgtgcccatcta

12、 3，下游序列：5* ctagaagcatttgcggtggacgatggaggg 31 ,擴(kuò)增片段 長度為660bpo pcr條件設(shè)置如下：94°c預(yù)變性5分鐘，94°c變性 45秒，57°c退火60秒，72°c延伸90秒，共循環(huán)28次，最后72°c 延伸10分鐘，終止反應(yīng)。6.3 rt pcr產(chǎn)物電泳 取pcr產(chǎn)物5卩1,置于1.5%瓊脂糖上， 80v電壓下電泳1小時(shí)，觀察并拍照。7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用完全隨機(jī)方羌分析，均數(shù)間比較采用lsd法。處理軟件：spss vll.ooo結(jié)果1 hmscs的形態(tài)學(xué)觀察原代接種24小吋后即可觀察到部分細(xì)胞貼壁

13、，大多呈圓形或橢圓 形；48-72小時(shí)后大多數(shù)細(xì)胞貼壁，呈現(xiàn)梭形、紡錘形。傳代培養(yǎng) 時(shí)hmscs貼壁速度快，絕大部分可在24小時(shí)之內(nèi)貼壁，為成纖維 細(xì)胞狀，伴有突起，核較大，呈橢圓形，核仁清晰（圖1）。在早期培 養(yǎng)，以5x103/cm2接種的hmscs培養(yǎng)5天可達(dá)90%匯合。hmscs經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)后，形態(tài)上由長梭形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榱⒎叫汀?多角型，胞漿色深，含粗大顆粒，胞核明顯（圖2）o觀察發(fā)現(xiàn)，10 8mol/l及以上濃度地塞米松處理的hmscs增殖速度比對照組慢。3地塞米松對hmscs alp活性的影響hmscs用不同濃度地塞米松分別處理8天，然后檢測各組細(xì)胞的 alp活性，結(jié)果如圖4所示。與

14、對照組相比，低濃度（109mol/l）地 塞米松對alp表達(dá)的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05),而10-8mol/l 及以上的濃度地塞米松可明顯增強(qiáng)alp的活性(p<001),均數(shù)的 增 幅 分 別 達(dá) 1316%(10-8mol/l 組)、228.2%(10-7mol/l 組)和 248.1%(10-6mol/l組)。組間分析顯示，10-8mol/l組與2個(gè)更高濃 度組(107、10-6mol/l組)相比均有顯著差異(p<0.05),而10- 7mol/l組和10-6mol/l組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)o4地塞米松作用下hmsc

15、s凋亡情況的檢測凋亡檢測結(jié)果顯示(如圖5),體外常規(guī)培養(yǎng)8天的hmscs凋亡 率()為3.68±0.21,實(shí)驗(yàn)組的凋亡率()分別為5.71 ±0.10(10-9mol/l 組)、7.7 ± 0.09 (10-8mol/l 組)、8.33 ±0.21 (10- 7mol/l組)和12.24±0.19 (10-6mol/l組)。由此可見，體外培養(yǎng) 的hmscs凋亡率隨地塞米松濃度的增加而升高。與對照組相比，各 種濃度地塞米松實(shí)驗(yàn)組凋亡率的增加均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p<0.01)o5地塞米松對hmscs opn基因表達(dá)的影響hmscs

16、經(jīng) 10-9、10-8、10-7、10-6mol/l 地塞米松作用 12 天后,均 有opn mrna表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度隨著地塞米松濃度增加而增強(qiáng)，對 照組則無相應(yīng)的條帶出現(xiàn)(圖6) o討論hmscs是一種源自骨髓基質(zhì)的干細(xì)胞，具有多向分化潛能，經(jīng)不 同條件誘導(dǎo)，可以分化為包括骨、軟骨、脂肪和神經(jīng)等多種組織細(xì) 胞。hmscs經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)后可以分化為成骨系細(xì)胞，外形呈立方 形，細(xì)胞器豐富，合成并分泌特異性alp、i型膠原、骨鈣素和 opn等1 o筆者的前期研究亦證實(shí)，mscs經(jīng)10-8mol/l地塞米 松誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)由成纖維細(xì)胞狀轉(zhuǎn)化為立方形或多角形，alp 染色、【型膠原和骨鈣素的免疫組化

17、染色及鈣化結(jié)節(jié)von kossa染 色呈陽性，具備了成骨細(xì)胞的特性2。本文在此基礎(chǔ)之上，深入 研究10-9、108、10-7和10-6mol/l 4種不同濃度地塞米松對mscs 成骨能力、增殖能力和凋亡率的影響。本研究選取alp活性和opn mrna的表達(dá)分別作為評價(jià)細(xì)胞成骨 能力的早、晚期指標(biāo)。alp是成骨細(xì)胞及其分化的早期標(biāo)志性酶， 能水解有機(jī)磷酸鹽釋放岀無機(jī)磷，并啟動鈣化進(jìn)程。alp的活性在 一定程度上反映了細(xì)胞的成骨能力。本研究數(shù)據(jù)顯示，高濃度(2 10-8mol/l)地塞米松可顯箸增強(qiáng)hmscs的alp活性，月活性隨著 地塞米松濃度的升高而增強(qiáng)，可達(dá)到對照組的23.5倍，但10-7

18、與10-6mol/l濃度組之間無顯著差異，提示10-8mol/l及以上濃度的 地塞米松可促進(jìn)hmscs成骨分化，但過高的濃度(106mol/l)并 不能提供更強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)功效，即存在“天花板效應(yīng)”。opn是由 成骨細(xì)胞分泌的一種高度磷酸化的糖蛋白，在類骨質(zhì)的礦化過程起 重要作用3, 4 o在成骨細(xì)胞分化晚期（基質(zhì)礦化期），opn與骨 鈣素等一起分泌至細(xì)胞外基質(zhì)中，與鈣、磷及膠原分子結(jié)合，形成 疑基磷灰石結(jié)晶。本研究的rt pcr結(jié)果顯示，不同濃度的地塞米 松組均有opn mrna表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度隨著地塞米松濃度增加而增 強(qiáng)。本研究結(jié)果證實(shí)地塞米松可促進(jìn)體外hmscs的成骨分化5 7,并提示地塞

19、米松對hmscs的成骨誘導(dǎo)能力上，10-7> 10- 6mol/l 濃度較 10-8mol/l 更強(qiáng)。有研究表明，地塞米松在促進(jìn)hmscs成骨分化的同時(shí)，抑制細(xì)胞 的增殖1,8。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在10-9至10-6mol/l的濃度 范圍內(nèi)，地塞米松對hmscs增殖的抑制作用呈劑量相關(guān)性，地塞米 松濃度越高抑制作用越明顯。但scs增殖影響存在不確定因素，促 進(jìn)、抑制或無影響都有可能。本文的凋亡檢測結(jié)果顯示，4種濃度 的地塞米松均可增加體外培養(yǎng)hmscs的凋亡率，且凋亡率隨地塞米 松濃度的升高而增高。oshina等10研究亦證實(shí)地塞米松能有選 擇性地促進(jìn)分化能力差的hmscs凋亡。在以ms

20、cs為種子細(xì)胞的骨組織工程中，應(yīng)處理好地塞米松促進(jìn)成 骨分化與抑制增殖和增加凋亡之間的關(guān)系。地塞米松的工作濃度以 10-8mol/l為佳，此濃度可顯著增強(qiáng)mscs的alp活性，同時(shí)對細(xì) 胞增殖的抑制作用較小，凋亡率也不高，可以獲得代謝活躍、分化 功能良好的有活力的種子細(xì)胞。此外我們認(rèn)為，高濃度的地塞米松雖能促進(jìn)mscs的成骨分化，但 明顯地抑制細(xì)胞增殖，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的增加，從而使得具有成骨 分化能力的有效骨祖細(xì)胞數(shù)量大量減少，最終對成骨作用在總體水 平上起負(fù)面效應(yīng)。另有研究表明，地塞米松可以促進(jìn)mscs成脂分 化11, 12。這兩方面因素協(xié)同作用，使得成骨與破骨作用之間 的動態(tài)平衡遭到破壞，

21、處于負(fù)平衡狀態(tài)，骨量不斷丟失，最終導(dǎo)致 骨質(zhì)疏松。這可能是臨床上大量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和（或）股骨頭無菌性壞死的發(fā)病機(jī)制之一 13-15 o【參考文獻(xiàn)】1 ogston n,hamson aj,cheung hf,et al.dexamethasone and retinoic acid differentially regulate gromortalized human clonal bone man*oal cell line ero prado m,bldzquez c,rodrlguez navas c,et al.functional characterization of

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