1、會計學(xué)1抗原抗原(kngyun)抗體的純化抗體的純化第一頁，共85頁。第1頁/共84頁第二頁，共85頁。第2頁/共84頁第三頁，共85頁。第3頁/共84頁第四頁，共85頁。第4頁/共84頁第五頁，共85頁。2021-12-186表表3-1 3-1 分離純化分離純化(chn hu)(chn hu)方法方法的比較的比較方方 法法原原 理理優(yōu)優(yōu) 點點缺缺 點點應(yīng)應(yīng) 用用離心分離法離心分離法離心力和物質(zhì)離心力和物質(zhì)沉降系數(shù)沉降系數(shù)的差別的差別操作簡單操作簡單分辨率低分辨率低蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì)分離鹽析法鹽析法鹽析作用鹽析作用操作簡單，成本低，操作簡單，成本低，重復(fù)性較好重復(fù)性較好分辨率低，純化分辨率低，純

2、化倍數(shù)低倍數(shù)低蛋白質(zhì)的分級沉蛋白質(zhì)的分級沉淀淀有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀法法脫水作用和降脫水作用和降低介電常低介電常數(shù)數(shù)操作簡單，分辨力操作簡單，分辨力較強較強 對蛋白質(zhì)有變性對蛋白質(zhì)有變性作用，成本作用，成本較高較高蛋白質(zhì)、多肽、蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖核酸和多糖的分級沉淀的分級沉淀凝膠層析法凝膠層析法分子篩的排阻分子篩的排阻作用作用分辨力強，不引起分辨力強，不引起蛋白質(zhì)變性蛋白質(zhì)變性成本高成本高分子質(zhì)量有差別分子質(zhì)量有差別的可溶性物的可溶性物質(zhì)質(zhì)離子交換法離子交換法離子基團的交離子基團的交換作用換作用分辨力強，分離量分辨力強，分離量大大費時間，酸堿用費時間，酸堿用量大量大可電離的生化物可電離

3、的生化物質(zhì)質(zhì)親和層析法親和層析法分離物與配體分離物與配體間的親和間的親和作用作用分辨力很強分辨力很強一種配體只分離一種配體只分離一類物質(zhì)，一類物質(zhì)，局限性大局限性大生命大分子物質(zhì)生命大分子物質(zhì)電電 泳泳物質(zhì)的帶電性物質(zhì)的帶電性質(zhì)質(zhì)設(shè)備簡單、操作方設(shè)備簡單、操作方便、分辨率高便、分辨率高成本高成本高生物分子的分離、生物分子的分離、定性、定量定性、定量第5頁/共84頁第六頁，共85頁。第6頁/共84頁第七頁，共85頁。2021-12-188l式中：式中： ：沉降固體顆粒的有效質(zhì)量：沉降固體顆粒的有效質(zhì)量(zhling)(zhling)（m m）；）；l ：離心半徑，轉(zhuǎn)子中心軸到沉降顆粒之間的距離：

4、離心半徑，轉(zhuǎn)子中心軸到沉降顆粒之間的距離(r)(r)；l ：離心機每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（：離心機每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（N N ）。）。2602NmrmrF第7頁/共84頁第八頁，共85頁。2021-12-189式中：式中：d d：沉降顆粒直徑：沉降顆粒直徑(zhjng)(zhjng)；：沉降顆粒密度；：沉降顆粒密度；：溶劑液：溶劑液體密度；體密度；：溶劑液體黏度；：溶劑液體黏度；1810)(132dS第8頁/共84頁第九頁，共85頁。第9頁/共84頁第十頁，共85頁。第10頁/共84頁第十一頁，共85頁。第11頁/共84頁第十二頁，共85頁。優(yōu)點：操作簡單、方便；優(yōu)點：操作簡單、方便；缺點：分離效果較差，費時

5、，不能一次得到純品；缺點：分離效果較差，費時，不能一次得到純品； 管壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別當(dāng)顆粒管壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別當(dāng)顆粒(kl)(kl)很大或濃度很高時很大或濃度很高時，沉淀出現(xiàn)在離心管壁一側(cè)；，沉淀出現(xiàn)在離心管壁一側(cè)； 顆粒顆粒(kl)(kl)被擠壓，離心力過大和離心時間過長，都被擠壓，離心力過大和離心時間過長，都會使顆粒會使顆粒(kl)(kl)變形、聚集而失活。變形、聚集而失活。第12頁/共84頁第十三頁，共85頁。（isopycnic gradient centrifugationisopycnic gradient centrifugation）適于）適于分離大小相同而密度不同的物質(zhì)。分離大

6、小相同而密度不同的物質(zhì)。第13頁/共84頁第十四頁，共85頁。2021-12-1815rnFFRCFgc251012. 1第14頁/共84頁第十五頁，共85頁。p離心時間時間過長或過短，離心時間時間過長或過短，都會影響顆粒在離心管內(nèi)的預(yù)都會影響顆粒在離心管內(nèi)的預(yù)期期(yq)位置，降低分離效果位置，降低分離效果。第15頁/共84頁第十六頁，共85頁。第16頁/共84頁第十七頁，共85頁。第17頁/共84頁第十八頁，共85頁。第18頁/共84頁第十九頁，共85頁。法等。法等。第19頁/共84頁第二十頁，共85頁。第20頁/共84頁第二十一頁，共85頁。第21頁/共84頁第二十二頁，共85頁。第22

7、頁/共84頁第二十三頁，共85頁。第23頁/共84頁第二十四頁，共85頁。第24頁/共84頁第二十五頁，共85頁。 p有機溶劑破壞溶質(zhì)分子有機溶劑破壞溶質(zhì)分子(fnz)周圍的水化層；有機溶劑降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白周圍的水化層；有機溶劑降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)的溶解度降低。質(zhì)的溶解度降低。第25頁/共84頁第二十六頁，共85頁。第26頁/共84頁第二十七頁，共85頁。第27頁/共84頁第二十八頁，共85頁。第28頁/共84頁第二十九頁，共85頁。第29頁/共84頁第三十頁，共85頁。第30頁/共84頁第三十一頁，共85頁。第31頁/共84頁第三十二頁，共85頁。第32頁/共84頁第三十三

8、頁，共85頁。第33頁/共84頁第三十四頁，共85頁。第34頁/共84頁第三十五頁，共85頁。離子交換法的固定相是離子交換劑；離子交換法的固定相是離子交換劑；若擔(dān)體帶有正電荷，可吸附著負(fù)電荷分子若擔(dān)體帶有正電荷，可吸附著負(fù)電荷分子(fnz)(fnz)，則為陰離子交換法；不帶凈電荷的分子，則為陰離子交換法；不帶凈電荷的分子(fnz)(fnz)，以及陽離子則直接流出，不會被吸附上去。，以及陽離子則直接流出，不會被吸附上去。這些被固相單體所吸附的離子，統(tǒng)稱為這些被固相單體所吸附的離子，統(tǒng)稱為 counter ion counter ion，因為其電荷與擔(dān)體上的電荷相反，因為其電荷與擔(dān)體上的電荷相反

9、(counter (counter 是是 相反相反 的意思的意思) )離子交換劑為人工合成的惰性高分子聚合物，其上帶有許多可電離基團，根據(jù)離子交換劑為人工合成的惰性高分子聚合物，其上帶有許多可電離基團，根據(jù)這些基團所帶電荷的不同，可分為這些基團所帶電荷的不同，可分為(fn wi)陰離子交換劑和陽離子交換劑。它陰離子交換劑和陽離子交換劑。它可分三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團和平衡離子?？煞秩糠郑焊叻肿泳酆衔锘|(zhì)、電荷基團和平衡離子。第35頁/共84頁第三十六頁，共85頁。H+ H+ 和和OH-OH-分別分別(fnbi)(fnbi)代表陽離子交代表陽離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子，換劑和

10、陰離子交換劑的平衡離子，Y+ Y+ 和和X-X-分別分別(fnbi)(fnbi)代表溶液中的代表溶液中的離子基團。離子基團。第36頁/共84頁第三十七頁，共85頁。離子交換層析對物質(zhì)的分離通常是在一根充填有離子交換劑離子交換層析對物質(zhì)的分離通常是在一根充填有離子交換劑的玻璃管（的玻璃管（1.5 cm15 cm）中進行的。中進行的。l含有預(yù)被分離的離含有預(yù)被分離的離子的溶液通過離子交子的溶液通過離子交換柱時，各種離子即換柱時，各種離子即與離子交換劑上的荷與離子交換劑上的荷電部位競爭結(jié)合。電部位競爭結(jié)合。l任何任何(rnh)離子通離子通過柱時的移動速率取過柱時的移動速率取決于與離子交換劑的決于與離

11、子交換劑的親和力、電離程度和親和力、電離程度和溶液中各種競爭性離溶液中各種競爭性離子的性質(zhì)和濃度。子的性質(zhì)和濃度。第37頁/共84頁第三十八頁，共85頁。第38頁/共84頁第三十九頁，共85頁。第39頁/共84頁第四十頁，共85頁。表表3-8 3-8 在陰離子交換柱上血漿蛋白在陰離子交換柱上血漿蛋白(dnbi)(dnbi)組分的分段洗脫組分的分段洗脫NaCl(mol/L)NaCl(mol/L)0.01mol/L PB0.01mol/L PB的的pHpH洗脫的蛋白質(zhì)洗脫的蛋白質(zhì)0.0250.0258.08.0IgGIgG0.0300.0307.07.0IgGIgG0.0350.0357.07.0

12、IgGIgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原0.0400.0407.07.0轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原0.0450.0457.07.02 2蛋白、白蛋白蛋白、白蛋白0.0500.0507.07.0IgAIgA、2 2蛋白、白蛋白蛋白、白蛋白0.0600.0606.56.5IgAIgA、白蛋白、白蛋白0.0700.0706.56.5白蛋白白蛋白0.0800.0806.56.52 2蛋白、蛋白、-脂蛋白、白蛋白脂蛋白、白蛋白0.0900.0906.56.52 2蛋白、珠蛋白、白蛋白蛋白、珠蛋白、白蛋白0.100.106.56.52 2蛋白、蛋白、-脂蛋白、珠蛋白、白蛋白脂

13、蛋白、珠蛋白、白蛋白0.150.156.56.5IgMIgM、-脂蛋白、脂蛋白、球蛋白球蛋白0.200.206.56.5銅藍蛋白、銅藍蛋白、蛋白蛋白第40頁/共84頁第四十一頁，共85頁。第41頁/共84頁第四十二頁，共85頁。p纖維素離子交換纖維素離子交換(l z jio (l z jio hun)hun)劑劑p交聯(lián)葡聚糖離子交換交聯(lián)葡聚糖離子交換(l z (l z jio hun)jio hun)劑劑p瓊脂糖離子交換瓊脂糖離子交換(l z jio (l z jio hun)hun)劑劑p陽離子交換陽離子交換(l z jio hun)(l z jio hun)劑、陰離子交換劑、陰離子交換(l

14、 z jio (l z jio hun)hun)劑（包括強、中、弱三種劑（包括強、中、弱三種離子交換離子交換(l z jio hun)(l z jio hun)基基團）團）第42頁/共84頁第四十三頁，共85頁。第43頁/共84頁第四十四頁，共85頁。第44頁/共84頁第四十五頁，共85頁。第45頁/共84頁第四十六頁，共85頁。凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多空網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、呈珠狀顆粒的物質(zhì)凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多空網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、呈珠狀顆粒的物質(zhì)(wzh)，每個顆粒的細微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致，像篩子，小的分，每個顆粒的細微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致，像篩子，小的分子可以進入凝膠網(wǎng)孔，而

15、大的分子則排阻于顆粒之外。子可以進入凝膠網(wǎng)孔，而大的分子則排阻于顆粒之外。一、基本原理一、基本原理第46頁/共84頁第四十七頁，共85頁。（1 1）蛋白質(zhì)混合物上柱）蛋白質(zhì)混合物上柱; ; （2 2）洗脫開始，小分子擴散進入凝膠顆粒內(nèi)，大分子則被排阻于顆粒之外）洗脫開始，小分子擴散進入凝膠顆粒內(nèi)，大分子則被排阻于顆粒之外; ; （3 3）小分子被滯留，大分子向下移動）小分子被滯留，大分子向下移動(ydng)(ydng)，大小分子開始分開，大小分子開始分開; ;（4 4）大小分子完全分開）大小分子完全分開; ; （5 5）大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在行進中。）大分子行程較短，已洗脫

16、出層析柱，小分子尚在行進中。第47頁/共84頁第四十八頁，共85頁。p如果兩種以上不同相對如果兩種以上不同相對(xingdu)分子質(zhì)量的分子都能進分子質(zhì)量的分子都能進入凝膠顆粒網(wǎng)孔，但由于它們被排阻和擴散的程度不同，入凝膠顆粒網(wǎng)孔，但由于它們被排阻和擴散的程度不同，在凝膠柱中所經(jīng)過的路程和時間也不同，從而彼此也可以在凝膠柱中所經(jīng)過的路程和時間也不同，從而彼此也可以分離開來。分離開來。p凝膠層析中物質(zhì)的分子量不是唯一的分離依據(jù)，有些物凝膠層析中物質(zhì)的分子量不是唯一的分離依據(jù)，有些物質(zhì)的分子量相同，但由于分子的形狀不同，再加上各種物質(zhì)的分子量相同，但由于分子的形狀不同，再加上各種物質(zhì)與凝膠之間存在

17、著非特異性的吸附作用，故仍然可分開質(zhì)與凝膠之間存在著非特異性的吸附作用，故仍然可分開。 第48頁/共84頁第四十九頁，共85頁。第49頁/共84頁第五十頁，共85頁。第50頁/共84頁第五十一頁，共85頁。第51頁/共84頁第五十二頁，共85頁。親和層析法有點像在釣魚，魚是我們所要的分子親和層析法有點像在釣魚，魚是我們所要的分子 (B) (B) 雜夾在一堆蛋白質(zhì)當(dāng)中，魚餌是雜夾在一堆蛋白質(zhì)當(dāng)中，魚餌是與與 B B 具有專一性的分子具有專一性的分子 (A, (A, 上圖上圖 1) 1)；A A 與與 B B 的專一性很高，只會在樣本的專一性很高，只會在樣本(yngbn)(yngbn)中與中與 B

18、 B 結(jié)合，而排除其它雜質(zhì)結(jié)合，而排除其它雜質(zhì) ( (上圖上圖 2) 2)；若把結(jié)合在吸著劑上的；若把結(jié)合在吸著劑上的 B B 溶離下來，就可溶離下來，就可以得到均質(zhì)的以得到均質(zhì)的 B ( B (上圖上圖 3) 3)。第52頁/共84頁第五十三頁，共85頁。第53頁/共84頁第五十四頁，共85頁。第54頁/共84頁第五十五頁，共85頁。第55頁/共84頁第五十六頁，共85頁。2021-12-1857表表3-16 3-16 親和層析中部分親和層析中部分(b fen)(b fen)蛋白配體蛋白配體配基配基純化的物質(zhì)純化的物質(zhì)蛋白蛋白A/A/蛋白蛋白B B各種免疫球蛋白各種免疫球蛋白單克隆抗體單克隆

19、抗體各種抗原、蛋白各種抗原、蛋白A A抗原抗原特異性單克隆抗體、特異性多克隆抗體特異性單克隆抗體、特異性多克隆抗體核苷酸核苷酸核苷酸結(jié)合蛋白、核苷酸酶核苷酸結(jié)合蛋白、核苷酸酶血凝素血凝素糖蛋白糖蛋白蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑蛋白酶蛋白酶脂肪酸脂肪酸脂肪酸結(jié)合蛋白、清蛋白脂肪酸結(jié)合蛋白、清蛋白糖糖血凝素、糖血凝素、糖苷苷甘酶甘酶生物素生物素親和素、生物素結(jié)合蛋白親和素、生物素結(jié)合蛋白肝素肝素凝血因子、酯酶、凝血因子、酯酶、DNADNA聚合酶、連接組織蛋白酶聚合酶、連接組織蛋白酶鈣調(diào)蛋白鈣調(diào)蛋白鈣調(diào)蛋白結(jié)合酶鈣調(diào)蛋白結(jié)合酶TriazineTriazine染料染料脫氫酶、激酶、多聚酶、干擾素、限止酶等

20、脫氫酶、激酶、多聚酶、干擾素、限止酶等第56頁/共84頁第五十七頁，共85頁。第57頁/共84頁第五十八頁，共85頁。第58頁/共84頁第五十九頁，共85頁。第59頁/共84頁第六十頁，共85頁。第60頁/共84頁第六十一頁，共85頁。第61頁/共84頁第六十二頁，共85頁。第62頁/共84頁第六十三頁，共85頁。第63頁/共84頁第六十四頁，共85頁。單體單體(dn t)(dn t)和交聯(lián)劑的總克數(shù)，用和交聯(lián)劑的總克數(shù)，用T%T%表表達達標(biāo)準(zhǔn)凝膠：大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)凝膠：大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)的分離采用的分離采用7.5%7.5%濃度的凝膠濃度的凝膠第64頁/共84頁第六十五頁，共85

21、頁。表表3-19 3-19 凝膠濃度凝膠濃度(nngd)(nngd)與被分離物相對分子量的關(guān)系與被分離物相對分子量的關(guān)系 物物 質(zhì)質(zhì)分子量范圍（分子量范圍（kDa）適用的凝膠濃度（適用的凝膠濃度（%）蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)51052030 1520 1015 510 25核酸核酸104 104105 10521061520 510 22.6第65頁/共84頁第六十六頁，共85頁。第66頁/共84頁第六十七頁，共85頁。第67頁/共84頁第六十八頁，共85頁。第68頁/共84頁第六十九頁，共85頁。返回(fnhu)第69頁/共84頁第七十頁，共85頁。(3)(3)電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)第70頁/共84頁第七十一

22、頁，共85頁。移率主要取決于它的分子量，移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)而與所帶電荷和形狀無關(guān)(wgun)。因此可以利用。因此可以利用SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量。測定蛋白質(zhì)分子量。這個技術(shù)首先是這個技術(shù)首先是1967年由年由shapiro建立，建立，1969年由年由Weber和和Osborn完善完善第71頁/共84頁第七十二頁，共85頁。第72頁/共84頁第七十三頁，共85頁。第73頁/共84頁第七十四頁，共85頁。第74頁/共84頁第七十五頁，共85頁。2021-12-1876表表3-1 3-1 分離分離(fnl)(fnl)純化方法的比較純化方法的比較方方 法法原原 理

23、理優(yōu)優(yōu) 點點缺缺 點點應(yīng)應(yīng) 用用離心分離法離心分離法離心力和物質(zhì)離心力和物質(zhì)沉降系數(shù)沉降系數(shù)的差別的差別操作簡單操作簡單分辨率低分辨率低蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì)分離鹽析法鹽析法鹽析作用鹽析作用操作簡單，成本低，操作簡單，成本低，重復(fù)性較好重復(fù)性較好分辨率低，純化分辨率低，純化倍數(shù)低倍數(shù)低蛋白質(zhì)的分級沉蛋白質(zhì)的分級沉淀淀有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀法法脫水作用和降脫水作用和降低介電常低介電常數(shù)數(shù)操作簡單，分辨力操作簡單，分辨力較強較強 對蛋白質(zhì)有變性對蛋白質(zhì)有變性作用，成本作用，成本較高較高蛋白質(zhì)、多肽、蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖核酸和多糖的分級沉淀的分級沉淀凝膠層析法凝膠層析法分子篩的排阻分子篩的排阻作用作用分辨力強，不引起分辨力強，不引起蛋白質(zhì)變性蛋白質(zhì)變性成本高成本高分子質(zhì)量有差別分子質(zhì)量有差別的可溶性物的可溶性物質(zhì)質(zhì)離子交換法離子交換法離子基團的交離子基團的交換作用換作用分辨力強，分離量分辨力強，分離量大大費時間，酸堿用費時間，酸堿用量大量大可電離的生化物可電離的生化物質(zhì)質(zhì)親和層析法親和層析法分離物與配體分離物與配體間的親和間的親和作用作用分辨力很強分辨力很強一種配體只分離一種配體只分離一類物質(zhì)，一類物質(zhì)，局限性大局限性大生命大分子物質(zhì)生命大分子物質(zhì)電電 泳泳物質(zhì)的帶電性物質(zhì)的帶電性質(zhì)質(zhì)設(shè)備簡單、操作方設(shè)備簡單、操作