1、單細(xì)胞RNA測(cè)序鑒定通過雙電位中間產(chǎn)物形成的早期感覺神經(jīng)元的多樣性導(dǎo)讀軀體感覺是由多種初級(jí)感覺神經(jīng)元的存在定義的，這些神經(jīng)元具有獨(dú)特的生物學(xué)特征以及對(duì)外部和內(nèi)部刺激的反應(yīng)特征。然而，關(guān)于細(xì)胞狀態(tài)的多樣性是如何在轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的，目前還沒有一個(gè)相對(duì)完整的概念。本研究使用深度單細(xì)胞RNA測(cè)序分析來解決小鼠感覺神經(jīng)發(fā)生過程中的分裂和分子偏倚過程，結(jié)果確定了有絲分裂后神經(jīng)元中一系列復(fù)雜的連續(xù)和特定的轉(zhuǎn)錄變化，這些變化描繪了導(dǎo)致主要感覺神經(jīng)元類別產(chǎn)生的遞階調(diào)節(jié)狀態(tài)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)早期表達(dá)的亞型與本研究之前未被發(fā)現(xiàn)的基因型有關(guān)?？傮w而言，感覺神經(jīng)元的早期多樣性是通過連續(xù)的雙電位中間產(chǎn)物產(chǎn)生的，其中相關(guān)基因模塊的

2、同步化和競(jìng)爭(zhēng)性命運(yùn)程序的同時(shí)抑制在細(xì)胞的穩(wěn)定和最終分裂到分化之前。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果1 分化軌跡和主要分裂 為了獲得小鼠胚胎發(fā)育期間從祖細(xì)胞向特定感覺亞型的譜系分裂圖，研究進(jìn)行了軀干的體感神經(jīng)-神經(jīng)膠質(zhì)子代的單個(gè)細(xì)胞(祖細(xì)胞和神經(jīng)元)的轉(zhuǎn)錄組。為此，研究者從小鼠品系中分離出樹突狀陽性(TOM+)細(xì)胞，其選擇性地代表所有的神經(jīng)干細(xì)胞(Wnt1CreR26tdTOM和Plp1CreERT2R26tdTOM)和神經(jīng)元特異性Cre小鼠品系(Isil 1 core；r26 dtomandntk3cre；R26tdTOM)，以從E9.5、E10.5、E11.5和E12.5中獲得體感神經(jīng)元群體

3、的富集(補(bǔ)充圖1a，b)，并使用Smart-seq2方案(每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到8070個(gè)基因的中值)對(duì)具有高覆蓋率的單細(xì)胞的mRNAs進(jìn)行測(cè)序(圖1a和補(bǔ)充圖1c，d)。 圖1.正在發(fā)展中的體感系統(tǒng)的scRNA-seq和偽時(shí)分析。a.單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集的UMAP嵌入表示，以胚胎日為注釋；b .RNA速度載體投射到UMAP包埋上，表明分化方向性。用ElPiGraph在擴(kuò)散空間上用半監(jiān)督的方法推斷的；c分化軌跡，顯示了12個(gè)主要簇群，分別位于兩個(gè)主軌跡（分支a和b）、10個(gè)分支和3個(gè)分支（1、2和3）?；蛄斜碓谠磾?shù)據(jù)文件中提供；d.e使用pagoda2提取的最重要的生物學(xué)特性表

4、明細(xì)胞狀態(tài)從循環(huán)（Sox10+和Sox2+）到有絲分裂后細(xì)胞（d）以及從非神經(jīng)元細(xì)胞到神經(jīng)元細(xì)胞（e）（Isl1+和Tubb3+）；f.與GO術(shù)語“細(xì)胞遷移的正調(diào)控”（GO:0030335）相關(guān)的基因集的PC分?jǐn)?shù)減去“細(xì)胞遷移負(fù)調(diào)節(jié)”的PC分?jǐn)?shù)（GO:0030336），表明從遷移的神經(jīng)嵴祖細(xì)胞向定居神經(jīng)元群體的過渡；g.所選基因的UMAP圖沿著軌跡分布，并在（ce）所代表的細(xì)胞狀態(tài)之間分布；h.神經(jīng)發(fā)生過程中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)動(dòng)態(tài)和神經(jīng)元特性表明，不同的狀態(tài)解釋了感覺亞類的分化，這些亞類可以根據(jù)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體和轉(zhuǎn)錄因子（Ntrk1、Ntrk2、Ntrk3、Ret、Runx1和Runx3）的特異性表達(dá)

5、進(jìn)行區(qū)分；i E12.5 DRG切片對(duì)（h）中突出顯示的標(biāo)記物進(jìn)行免疫染色，表示軌跡終點(diǎn)和量化（n=3-5）。比例尺，20µm。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示；j.基于我們的scRNAseq數(shù)據(jù)分析的神經(jīng)干細(xì)胞源于A支感覺神經(jīng)元分化的層次分叉模型（根據(jù)面板h的顏色編碼和聚類標(biāo)識(shí)）?；旌仙綁K反映了血統(tǒng)在相應(yīng)的發(fā)展點(diǎn)上保留的潛在命運(yùn)選擇。 選擇的階段對(duì)應(yīng)于感覺譜系發(fā)展的關(guān)鍵事件，從遷移的ncc（E9.5）開始，到第二波感覺神經(jīng)發(fā)生的結(jié)束和神經(jīng)元亞型的早期鑒定（E12.5）。數(shù)據(jù)集包含來自Isl1Cre的細(xì)胞；R26DTOMATE9.5和E10.5和Ntrk3Cre；R26

6、DTOMAT E11.5和E12.5，這兩條線都標(biāo)記感覺神經(jīng)元，Wnt1Cre；R26DTOMWAS用于標(biāo)記NCC、E9.5和E10.5處的神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)祖細(xì)胞，以及Plp1CreERT2；R26dtomatE12.5。用這些Cre系追蹤后收集的細(xì)胞組合應(yīng)提供完整的小鼠DRG神經(jīng)祖細(xì)胞和早期神經(jīng)元亞型的概要（FACS門控策略見補(bǔ)充圖2）。所有追蹤策略的細(xì)胞的共嵌入沒有基于追蹤的批量校正，并導(dǎo)致不同追蹤的細(xì)胞重疊，同時(shí)遵循發(fā)育時(shí)間軌跡和從祖細(xì)胞到特定神經(jīng)元的進(jìn)展（圖1a-e和補(bǔ)充圖1a、b；軌跡見下文）令人信服地驗(yàn)證了數(shù)據(jù)集用于進(jìn)一步計(jì)算分析的使用。 首先將數(shù)據(jù)集投影到擴(kuò)散空

7、間以去除底層幾何體的噪聲，并且借助聚類結(jié)果，使用elpigraph以半監(jiān)督的方式擬合了主樹（圖1b，c）。捕獲了樹根種群和端點(diǎn)以及中間狀態(tài)作為子簇，從而確定了兩個(gè)主要的神經(jīng)源性軌跡，即分支A和分支B（圖1c）。這些分支是從祖細(xì)胞到有絲分裂后新生神經(jīng)元的明顯轉(zhuǎn)變演變而來的，這是用Pagoda2（圖1d，e）確定的。Pagoda2將譜系樹分為兩種主要狀態(tài)，即循環(huán)（Sox10+和Sox2+）與非循環(huán)（Isl1+），對(duì)應(yīng)于非神經(jīng)元和神經(jīng)元群體，后者由軸突相關(guān)細(xì)胞骨架和功能基因（包括Tubb3，編碼III微管蛋白）的特異性表達(dá)來定義（圖1d，e）。一直以來，SOX10+電池合并EdU（循環(huán)細(xì)胞），且不與

8、有絲分裂后神經(jīng)元標(biāo)記物ISL1共定位（補(bǔ)充圖3a）。III微管蛋白染色標(biāo)記感覺神經(jīng)元，與同樣為EdU+的SOX2+細(xì)胞不共定位（補(bǔ)充圖3b）。細(xì)胞遷移GO-term基因集的陽性（GO:0030335）和陰性（GO:0030336）調(diào)控的PC評(píng)分顯示從遷移的ncc向神經(jīng)元祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)變（圖1f）。微環(huán)境，包括整合素亞單位，與細(xì)胞外基質(zhì)動(dòng)態(tài)結(jié)合和相互作用的主要受體，它代表了運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的一個(gè)必要特性（補(bǔ)充圖3c）。神經(jīng)祖細(xì)胞和神經(jīng)元是由促進(jìn)細(xì)胞間粘附的鈣粘蛋白基因表達(dá)的轉(zhuǎn)換來定義的（補(bǔ)充圖3d）。發(fā)現(xiàn)揭示了與遷移前體和遷移后神經(jīng)元祖細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞粘附性變化的一般原理和分子途徑。 祖細(xì)胞中，A支

9、和B支分化成終末神經(jīng)元簇，E12.5表達(dá)主要早期DRG神經(jīng)元群的分子標(biāo)記：本體感受型、機(jī)械感受型和傷害性群體。本體感受譜系在E12.5處的特征是Ntrk3（編碼TRKC的Ntrk3）與Runx31315共表達(dá)，而機(jī)械感受神經(jīng)元表達(dá)Ret和Ntrk2（Ntrk2編碼TRKB）（圖1gi和源數(shù)據(jù)文件）。B分支分化為傷害性Ntrk1+（TRKA）細(xì)胞，其特征是Ntrk1的表達(dá)（以及TRKA+細(xì)胞中Runx1的開始誘導(dǎo)）（圖1gi），這是傷害性譜系5的一個(gè)特異性標(biāo)記。上述群體標(biāo)記的組合使用涵蓋了該階段所有（ISL1+）19個(gè)感覺神經(jīng)元（圖1i）。 通過代表早期感覺神經(jīng)元的主要類別，研究者的數(shù)

10、據(jù)集和分析產(chǎn)生了體感神經(jīng)元多樣化樹的精確順序，其中祖細(xì)胞經(jīng)歷了快速的轉(zhuǎn)錄變化，這些變化通過逐步分支點(diǎn)和離散的感覺神經(jīng)元狀態(tài)進(jìn)行，符合不同神經(jīng)元類型出現(xiàn)的發(fā)展順序（圖1j）。 2 干細(xì)胞群和感覺神經(jīng)發(fā)生波 在神經(jīng)嵴遷移期間，連續(xù)的祖細(xì)胞池依賴于NGN2或NGN1產(chǎn)生第一波的大尺寸神經(jīng)元(主要是TRKC+、TRKB+和RET+神經(jīng)元)，然后分別產(chǎn)生第二波神經(jīng)發(fā)生的小尺寸TRKA+神經(jīng)元。第三波神經(jīng)發(fā)生來自邊界帽細(xì)胞(基底細(xì)胞，也來源于神經(jīng)細(xì)胞)，主要產(chǎn)生小體積的TRKA+神經(jīng)細(xì)胞。該領(lǐng)域的一個(gè)主要問題是細(xì)胞在神經(jīng)發(fā)生過程中如何從一種狀態(tài)發(fā)展到另一種狀態(tài)，以及神經(jīng)發(fā)生程序如何指定

11、導(dǎo)致特定神經(jīng)元亞型的神經(jīng)發(fā)生的兩個(gè)主要波。為了解決這些問題，研究者首先確定了不同的細(xì)胞群和軌跡。在本研究的數(shù)據(jù)集中，定義分化樹起源的聚類1-3（循環(huán)細(xì)胞）顯示剩余神經(jīng)板邊界基因（如Zic和Msx，僅在集群1的少數(shù)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)），NCCs說明符的上調(diào)(Sox9、Foxd3和Ets1)和參與NCCs遷移的基因的表達(dá)(Cdh11和Itga4，后者在簇2和3之間的橋中高度表達(dá))（圖2a，b）。此外，隨著RNA速度流，簇2和簇3開始表達(dá)原神經(jīng)發(fā)生標(biāo)記（Neurog1和Neurog2）（圖2c），將這些群體定義為神經(jīng)祖細(xì)胞。研究者將這三組標(biāo)記為早期NCC（聚類1，頂部差異表達(dá)基因（TDEGs）；Prtg、C

12、rabp1、Snai1和Dlx2）、晚期NCC（lNCCs，cluster 2，TDEGs:Hoxd10、Hoxd11、Hoxa11和Hoxc12）和LNCC/BCCs（聚類3，TDEGs:Fabp7、Sparc、Serpine2和Ednrb）（圖2a，b)。 測(cè)序數(shù)據(jù)的比對(duì)顯示出兩條軌跡（或分支）從高度異質(zhì)的簇NCC和LNCS/BCCs中出現(xiàn)導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)生，將其命名為分支A和分支B，（圖2c）。分析還表明，雖然來自lNCCs/BCCs的神經(jīng)祖細(xì)胞只表達(dá)Neurog1，但不能根據(jù)其特定的NGN表達(dá)來區(qū)分兩個(gè)主要的神經(jīng)發(fā)生軌跡（分支A和B，圖2c）。事實(shí)上，在這兩個(gè)分支中，前體細(xì)胞從Ne

13、urog2+進(jìn)化到Neurog1+狀態(tài)（圖2d），大量單個(gè)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)這兩種轉(zhuǎn)錄物（圖2eg）。NGN2和NGN1在神經(jīng)發(fā)生的第一波和第二波中分別有特定的表達(dá)。在這兩個(gè)小鼠中，在所有類別的DRG神經(jīng)元中都觀察到重組（TOM+），不管它們的神經(jīng)發(fā)生波（圖2h-l），確認(rèn)了最近一項(xiàng)研究的結(jié)果。大多數(shù)感覺神經(jīng)元前體細(xì)胞在兩個(gè)基因共同表達(dá)的中間狀態(tài)下依次表達(dá)Neurog2和Neurog1，并提示產(chǎn)生第一波或第二波神經(jīng)發(fā)生的神經(jīng)元前體適時(shí)地傾向于優(yōu)先需要NGN2或NGN1作為神經(jīng)元區(qū)別。  圖2.神經(jīng)嵴干細(xì)胞群和感覺神經(jīng)發(fā)生波。a.b： NCCs異質(zhì)性由不同的循環(huán)細(xì)胞簇（1

14、3）（a）（圖1d）定義，這些細(xì)胞群由標(biāo)記物的特異性表達(dá)標(biāo)記，并描繪出早期神經(jīng)嵴細(xì)胞（eNCCs）、晚期NCCs（lNCCs）和邊界帽細(xì)胞（lNCCs/BCCs）（b），（b）中的RNA速度顯示了從eNCCs到lNCCs，然后到lNCCs/BCCs的定向轉(zhuǎn)錄流。lNCC和lNCC/BCC的一些細(xì)胞聚集到神經(jīng)源性狀態(tài)（粉紅色）；c.d：用RNA速度計(jì)算分析神經(jīng)源性小生境，顯示主要神經(jīng)源性轉(zhuǎn)錄因子Neurog2和Neurog1的順序表達(dá)； e：在E10.5DRG切片上對(duì)Neurog1和Neurog2進(jìn)行RNAscope染色，證實(shí)它們?cè)谕蛔婕?xì)胞中共表達(dá)。比例尺，10µm；f.&

15、#160;Neurog1和Neurog2的單細(xì)胞值圖顯示，在E10.5假時(shí)間之后，祖細(xì)胞中存在三個(gè)階段，包括Neurog2和Neurog1在單細(xì)胞水平上的同時(shí)表達(dá)（虛線內(nèi)，136個(gè)細(xì)胞）；g：神經(jīng)元前體細(xì)胞中伴隨的平均表達(dá)的定量反映了從Neurog2高表達(dá)到低表達(dá)和Neurog1從低到高的動(dòng)態(tài)表達(dá)范圍。數(shù)據(jù)以最小至最大觸須圖的形式呈現(xiàn)，中心點(diǎn)為平均值；h：來自Neurog2Creer2的E18.5 DRG的橫截面圖；在E9.5和E10.5處用三苯氧胺注射的R26dt顯示來自兩個(gè)神經(jīng)發(fā)生波（分支A和B）的神經(jīng)元中的重組，如TOM在大直徑神經(jīng)元和小直徑TRKA陽性神經(jīng)元（星號(hào)）中的表達(dá)所示（箭頭指

16、向TRKA+/RFP細(xì)胞），比例尺，20µm；ik.每只動(dòng)物分析533個(gè)TOM+細(xì)胞（ik，n=4）。在RFP+神經(jīng)元中，半數(shù)以上為TRKA陽性（j），直徑小于或等于15m（k）。比例尺，50µm。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM；l：類似于（h），使用Neurog1Cre；R26tdTom（n=3）；m：鑒定A支和B支之間表達(dá)的共同轉(zhuǎn)錄組程序，導(dǎo)致所有感覺神經(jīng)元（n）；o：產(chǎn)生A支神經(jīng)元（有髓，大直徑）或B支神經(jīng)元（無髓，小直徑）的特定基因模塊；p：轉(zhuǎn)錄因子活性推斷顯示預(yù)測(cè)分支特異性活性。3 有髓和無髓神經(jīng)元的神經(jīng)發(fā)生。 研究者分析了有髓和無髓神經(jīng)元分化的發(fā)生

17、和關(guān)鍵分子決定因素。為此，使用擴(kuò)散圖來計(jì)算比較兩種神經(jīng)發(fā)生軌跡，即分支A和分支B（圖2m），推斷出一個(gè)公共點(diǎn)，表示擴(kuò)散空間中兩個(gè)分支最接近的位置（圖2n）。在Sox10表達(dá)之后，Neurog2接著是Neurog1，然后是Neurod4、Pou4f1（BRN3A）、Neurod1和Isl1。兩個(gè)主要軌跡共有的聚合基因定義了一個(gè)通用的感覺分化程序（圖2n）。常見的基因包括Neurod1和Neurod4，它們是保守的原發(fā)性轉(zhuǎn)錄因子，以及Sox2和Sox5，它們代表了先前未描述的發(fā)現(xiàn)，可能在體感系統(tǒng)的發(fā)育中起到特定的作用（圖2p和補(bǔ)充圖2）。同時(shí)，不同的基因特定于任何一個(gè)軌跡區(qū)分有髓譜系（A支）和無髓

18、譜系（B支）（圖2o）。具體而言，發(fā)現(xiàn)Nfia、Gli2和Neurod2參與B支（圖2o和補(bǔ)充圖2），表明不同的TFs在A支和B支的感覺神經(jīng)發(fā)生過程中起著關(guān)鍵作用。研究者檢查了轉(zhuǎn)錄變化的過程和代表神經(jīng)元亞型多樣化事件的分支點(diǎn)，重點(diǎn)分析了沿著分支A的三個(gè)下游分支（圖3a）。每一個(gè)分叉可分為三個(gè)中間階段：分叉前（根）、分叉點(diǎn)和分叉后的軌跡部分（圖3b）。分叉前和分叉后階段分別揭示了導(dǎo)致命運(yùn)選擇及其鞏固的轉(zhuǎn)錄變化動(dòng)態(tài)。在分支A中，第一個(gè)分支對(duì)應(yīng)于機(jī)械感受器和本體感受器之間的二元細(xì)胞命運(yùn)選擇（圖3b，c）。研究者確定了兩個(gè)主要的早期基因模塊，與分叉前階段（圖3d）的固有感受器（45個(gè)基因）或機(jī)械感受器

19、（60個(gè)基因）的命運(yùn)分裂有關(guān)，以及定義細(xì)胞承諾的晚期基因模塊（圖3e）。當(dāng)細(xì)胞在假時(shí)間軸上生長(zhǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因模塊最初在單個(gè)細(xì)胞中共同表達(dá)，然后逐漸相互排斥，走向與命運(yùn)選擇偏好相關(guān)的分叉點(diǎn)（圖3d）。a -纖維低thresold機(jī)制受體分化軌跡的第二次分叉代表了僅Ntrk2和Ntrk2/Ret之間的命運(yùn)選擇(圖3f-h)。模塊決定他們的命運(yùn)分裂偏向Ntrk2或Ntrk2/Ret群體(圖3i, j)顯示軸突引導(dǎo)受體活性(GO:0008046)對(duì)Ntrk2只有命運(yùn)的富集。 有髓譜系早期細(xì)胞內(nèi)的這些早期模塊之間存在競(jìng)爭(zhēng)，這可能導(dǎo)致將來的命運(yùn)分裂偏向于機(jī)械感受器或本體感受器（分支1，圖4a

20、）（或朝向觸覺機(jī)械感受器的兩個(gè)不同亞群分叉2，圖4b）在實(shí)際分裂發(fā)生之前（圖4a，b）。這些早期偏壓模件在分叉前最初在單胞水平上局部呈現(xiàn)正相關(guān)（圖4a，b，模內(nèi)，見箭頭），并且在分叉前階段呈現(xiàn)出模間負(fù)相關(guān)的增加（圖4a，b，c），因此，建議在命運(yùn)承諾之前共同激活競(jìng)爭(zhēng)偏倚程序（圖4c-f）。因此，保留下來的程序?qū)⑴c一種細(xì)胞類型與另一種細(xì)胞類型命運(yùn)的展開。  圖3.沿分化軌跡定義命運(yùn)選擇和承諾的基因模塊的表達(dá)。a.UMAP嵌入的分支分析綜述。b分析代表本體感受器和機(jī)械感受器譜系之間命運(yùn)選擇的分歧（圖1c的分支8和9）；c.UMAP圖顯示機(jī)械感受器和本體感受器譜系標(biāo)記的表達(dá)，并

21、在體內(nèi)驗(yàn)證（見補(bǔ)充圖3）；e散點(diǎn)圖顯示機(jī)械感受器和本體感受器模塊沿著機(jī)械感受器和本體感受器譜系在每個(gè)細(xì)胞中的平均表達(dá)。早期競(jìng)爭(zhēng)模件（d）表現(xiàn)為逐漸的共激活，隨后選擇性上調(diào)一個(gè)命運(yùn)特異性模件，下調(diào)另一個(gè)命運(yùn)特異性模件。后模（e）在分叉后，在本體感受器和機(jī)械感受器中表現(xiàn)出幾乎互斥的表達(dá)，反映了對(duì)任何一種命運(yùn)的承諾。顏色代碼如（a）所示。前十個(gè)差異表達(dá)最高的基因，以及轉(zhuǎn)錄因子（TF）；f.代表Ntrk2和Ret/Ntrk2譜系之間機(jī)械感受器命運(yùn)選擇的分叉分析（圖1c的分支10和11）。g.h分支的體內(nèi)驗(yàn)證，Anxa2表達(dá)Ntrk2命運(yùn)，Grik1表達(dá)Ret/Ntrk2命運(yùn)（n=3只動(dòng)物）。比例尺，1

22、0µm；i.j散點(diǎn)圖顯示Ntrk2和Ret/Ntrk2模塊在兩個(gè)機(jī)械感受器亞系中的平均表達(dá)。早期的競(jìng)爭(zhēng)模塊（i）表現(xiàn)出逐漸的協(xié)同激活，然后選擇性地上調(diào)一個(gè)命運(yùn)特定的模塊和下調(diào)另一個(gè)命運(yùn)特定的模塊。后模（j）在分叉后的兩個(gè)機(jī)械感受器譜系中幾乎相互排斥表達(dá)。顏色代碼如（a）所示。前十個(gè)差異表達(dá)最高的基因，以及轉(zhuǎn)錄因子（TF）。圖4.早期的命運(yùn)決定基因或模塊顯示了在細(xì)胞命運(yùn)選擇過程中逐漸的模塊內(nèi)協(xié)調(diào)和模塊間排斥。a.b對(duì)于分支1和分支2，假時(shí)間分析中的圖顯示了分支特定模塊內(nèi)和之間的基因平均局部相關(guān)性，每個(gè)模塊內(nèi)的協(xié)調(diào)性逐漸增加，分支特定模塊之間的拮抗表達(dá)增加；c.d在一組發(fā)育時(shí)間相似的細(xì)胞

23、中（用黑點(diǎn)標(biāo)記），兩個(gè)分支的模塊基因與分支特異的早期基因模塊的平均局部相關(guān)性。模塊內(nèi)和模塊間相關(guān)性之間的差異，表征了交替模塊之間的拮抗表達(dá)程度，顯示在相關(guān)圖的右上角，并以（d）中的圖表表示為Y軸上的絕對(duì)值，該值將反映模塊之間的排斥；e.感覺神經(jīng)元二元命運(yùn)決定示意圖；f.兩個(gè)分支的基因模塊排斥作用在不同的假時(shí)間t達(dá)到峰值。 4 體內(nèi)細(xì)胞命運(yùn)偏向程 為了研究早期基因模塊中的TFs如何影響體內(nèi)的命運(yùn)選擇，研究者集中于RUNX 3的作用，該作用在本體感受器/機(jī)械感受器軌跡的分叉前階段在部分感覺神經(jīng)元中表達(dá)，并且在分叉后的所有本體感受器中都存在（圖3c，d，5a，b）。使用Runx3

24、-/-; Bax-/-動(dòng)物，其中Bax的缺失使得可以在不存在細(xì)胞死亡的情況下研究RUNX3的功能，我們觀察到E12.5 DRG中TRKB +細(xì)胞的比例增加了三倍（圖 5c），類似于先前的結(jié)果。在缺少Runx3的GFP +細(xì)胞中，前本體感受器決定中鑒定的大量前耳基因和晚期基因被顯著下調(diào)（即Runx3，F(xiàn)am19a4，Cntnap2，Shisa6，Anxa2，圖5d，藍(lán)點(diǎn)），而某些被鑒定為前體感受器的基因則顯著上調(diào)。（即Ntrk2，Gfra2，Pou6f2，Gpm6a，Plxna2，圖5d，紅點(diǎn)），表明在感覺神經(jīng)元多樣化期間，在細(xì)胞命運(yùn)選擇之前存在競(jìng)爭(zhēng)的遺傳程序。 圖5.早期分支特異基因

25、RUNX3是分裂決定前命運(yùn)偏差的關(guān)鍵因子。a.分叉分析；b.Runx3沿軌跡的假時(shí)間顯示，Runx3在細(xì)胞分叉點(diǎn)之前上調(diào)。顏色編碼分支，如圖4a所示；c.對(duì)TRKB和ISL1染色的Runx3+/+；Bax/和Runx3/；Bax/E12.5胚胎（n=4）的DRG部分顯示，在缺少Runx3的情況下，TRKB+神經(jīng)元的數(shù)量增加了三倍。比例尺，50µm。*P<0.0001。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示；d.unx3+/GFPand Runx3GFP/GFPDRG神經(jīng)元（E11.5）之間差異表達(dá)基因的火山圖，顯示屬于本體感受器軌跡早期基因模塊的基因下調(diào)，屬于機(jī)械感受器軌跡早期基因

26、模塊的基因上調(diào)；e.總結(jié)研究結(jié)果的方案5 神經(jīng)元分化過程中轉(zhuǎn)錄程序的融合 本研究最后的研究是定義最不同的簇的具體特征，軌跡的端點(diǎn)(圖6a)。數(shù)據(jù)顯示，成熟為不同的神經(jīng)元類型時(shí)，又在轉(zhuǎn)錄水平上重新聚合，根據(jù)分析的終點(diǎn)神經(jīng)元類型之間的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性相對(duì)較少（圖6b）和GO項(xiàng)類別的高度重疊（圖6c）來判斷。分析可以在構(gòu)成分支A和分支B軌跡端點(diǎn)的簇間識(shí)別出大約120 - 180個(gè)差異表達(dá)基因(圖7)。其中一些基因是亞群特有的標(biāo)記（圖6a）。E12.5處表達(dá)的與神經(jīng)元功能相關(guān)的基因模塊（圖6d，e）。在E12.5，研究人員發(fā)現(xiàn)44個(gè)基因從有絲分裂的神經(jīng)元祖細(xì)胞傳遞到所有有絲分裂后的感覺神經(jīng)元，這些

27、基因編碼決定神經(jīng)傳遞表型和神經(jīng)元特有的形態(tài)學(xué)特征（最具代表性的GO術(shù)語：軸突神經(jīng)元投射、髓鞘和細(xì)胞投射）（圖6f），這些基因在多樣性樹的各個(gè)層次上都得到了保留，并且在成人的感覺神經(jīng)元中仍然發(fā)現(xiàn)了這些基因由三個(gè)子單元組成：外周感覺神經(jīng)絲神經(jīng)元、外周感覺非肽能神經(jīng)元和外周感覺肽能神經(jīng)元（圖6g，h）。因此，本研究的數(shù)據(jù)提供了一組定義從感覺祖細(xì)胞到成年感覺神經(jīng)元的整個(gè)感覺譜系的基因（圖6i）。 圖6.主要神經(jīng)元終末亞型。a.終點(diǎn)軌跡分析確定不同感覺譜系中差異表達(dá)的基因；b.在所有不同的細(xì)胞群中，隨著差異化程度的降低，在所有的細(xì)胞簇中都檢測(cè)到了差異化程度最低的基因簇；c.感覺譜系的GO術(shù)語顯

28、示了神經(jīng)元亞型之間的類別冗余；d-f基因從祖細(xì)胞到子代神經(jīng)元的傳遞是通過首先識(shí)別軌跡終點(diǎn)處的共同基因，然后通過回溯這些基因模塊直到循環(huán)的神經(jīng)元祖細(xì)胞（d）來研究。我們發(fā)現(xiàn)43個(gè)基因已經(jīng)在祖細(xì)胞群中表達(dá)；這些基因?qū)儆冢╢）中的GO術(shù)語類別，并且都與神經(jīng)元過程有關(guān)；g.h發(fā)育過程中43個(gè)已識(shí)別基因的假時(shí)間（g，簇色碼與圖1c相似），在成年DRG神經(jīng)元（h）中仍有表達(dá)：外周感覺神經(jīng)絲神經(jīng)元（PSNn），外周感覺非肽能神經(jīng)元（PSNPn）和外周感覺肽能神經(jīng)元（PSPn）（數(shù)據(jù)來源網(wǎng)站) . N（g）和d（h）代表同一個(gè)基因?；蛄斜碓谠磾?shù)據(jù)文件中提供；i.顯示有絲分裂母細(xì)胞

29、傳遞給子代神經(jīng)元并保持到成年的ID神經(jīng)元標(biāo)記。 圖7.結(jié)果示意圖。通過我們數(shù)據(jù)集中無髓（傷害性）和有髓（觸覺-機(jī)械感受和本體感受）譜系神經(jīng)元不同軌跡的神經(jīng)發(fā)生示意圖。 討論調(diào)節(jié)體感神經(jīng)元命運(yùn)的分子機(jī)制尚未完全了解，這主要是由于特定的挑戰(zhàn)，包括相對(duì)快速的神經(jīng)發(fā)生過程，以及在感覺神經(jīng)節(jié)結(jié)合的位置大量混合祖細(xì)胞和細(xì)胞類型。本研究對(duì)哺乳動(dòng)物體感系統(tǒng)中的神經(jīng)發(fā)生進(jìn)行了全面的基于scRNAseq的分析，并確定了獨(dú)特的和混合的譜系轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)，這些轉(zhuǎn)錄組進(jìn)化到特定的神經(jīng)元亞型（圖7）。此外，研究提供了一個(gè)早期發(fā)育動(dòng)態(tài)的分析，揭示了早期體感神經(jīng)元的出現(xiàn)。確定了一個(gè)組合過程，通過這個(gè)過程，細(xì)胞

30、類型特異性神經(jīng)元身份出現(xiàn)，并揭示了在導(dǎo)致具體感覺亞型的多樣化樹中的命運(yùn)分支點(diǎn)之前，早期分裂的祖細(xì)胞和神經(jīng)元的異質(zhì)群體中先前的命運(yùn)相關(guān)變化。循環(huán)細(xì)胞之間導(dǎo)致神經(jīng)元多樣性的二元決定在發(fā)育早期祖細(xì)胞不對(duì)稱分裂或前體譜系前模式的背景下被大量描述.數(shù)據(jù)顯示，新生的感官在一個(gè)軌跡內(nèi)的神經(jīng)元來自一個(gè)相對(duì)同質(zhì)的細(xì)胞群體，神經(jīng)元的分子特異性是通過一系列連續(xù)的二元決策沿著偽時(shí)間軸逐步獲得的。在胚胎后期體感發(fā)育過程中，例如在TRKA+/RUNX1+傷害感受器分化為肽能和非肽能的感覺神經(jīng)元群的過程中，已經(jīng)有人提出了通過相互抑制活動(dòng)進(jìn)行分支分離的概念，然而,時(shí)機(jī)和基因調(diào)控策略,調(diào)節(jié)分化過程仍然知之甚少。 數(shù)據(jù)表明，在發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)中，早期神經(jīng)元類型的命運(yùn)分布機(jī)制，即有絲分裂后神經(jīng)元群體的命運(yùn)偏倚異質(zhì)性逐漸增加，直到二元決策的確定點(diǎn)。類似于多能干NCC譜系樹的其他命運(yùn)形成過程。分叉事件的分子基礎(chǔ)沿著體感發(fā)展的層次決策樹揭示了在分叉之前細(xì)胞中雙電位轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的初始共激活，隨后逐漸向細(xì)胞命運(yùn)承諾和二元決策轉(zhuǎn)變。因此，在早期發(fā)育過程中，通過增加相關(guān)程序的同步性（作為關(guān)鍵的譜系啟動(dòng)因子）以及