1、實(shí)驗(yàn)二 特殊顯微鏡一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?實(shí)驗(yàn)原理三 實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑四 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法五 實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.了解和掌握相差顯微鏡、熒光顯微鏡、暗視野顯鏡的構(gòu)造原理和使用方法 2.學(xué)習(xí)制造暗視野擋板實(shí)驗(yàn)原理 1. 暗視野顯微鏡在構(gòu)造上應(yīng)用了光學(xué)上的丁達(dá)爾現(xiàn)象。和普通光學(xué)顯微鏡相比，它在聚光鏡中央有擋光片，使照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍，但是只能看到物體的存在和運(yùn)動(dòng)，不能辨清其結(jié)構(gòu)。主要用來觀察活細(xì)胞中微粒的運(yùn)動(dòng)，觀察單細(xì)胞、硅藻、放線菌、細(xì)菌的線

2、狀結(jié)構(gòu)如鞭毛和纖維等。 實(shí)驗(yàn)原理 2. 光線通過比較透明的標(biāo)本時(shí)，光的波長(顏色)和振幅(亮度)都沒有明顯的變化。因此用普通光學(xué)顯微鏡觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本(如活的細(xì)胞)時(shí)，其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)往往難以分辨。然而由于細(xì)胞各部分的折射率和厚度的不同，光線通過標(biāo)本時(shí)，直射光和衍射光的光程就會(huì)有差別。隨著光程的增加或減少，加快或落后的光波的相位會(huì)產(chǎn)生相位差。光的相位差人的肉眼感覺不到，但相差顯微鏡能通過其特殊裝置安裝在聚光器中的環(huán)狀光闌和物鏡中的相板，利用光的干涉現(xiàn)象，將光線通過透明標(biāo)本細(xì)節(jié)時(shí)所產(chǎn)生的光程差(即相位差)轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢圆煊X的振幅差(明暗差)，從而使原來透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異，對比度增強(qiáng)

3、，能比較清楚的觀察到普通光學(xué)顯微鏡和暗視野顯微鏡下看不清的活細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的某些細(xì)微結(jié)構(gòu)。 實(shí)驗(yàn)原理 3.熒光顯微鏡是利用較短波長的紫外光照射標(biāo)本，使樣品受到激發(fā)，產(chǎn)生較長波長的熒光，可以用來觀察和分析樣品中產(chǎn)生熒光的成分和結(jié)構(gòu)、位置。細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可自發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光。 實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑 普通光學(xué)顯微鏡、相差顯微鏡、多功能顯微鏡、黑卡紙、圓規(guī)、剪刀、直尺、草履蟲、載玻片、蓋玻片、擦鏡紙、吸水紙、棉花等實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法(一)暗視野顯微鏡1.構(gòu)造原理實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法2.使用注意事項(xiàng)(1)聚光器

4、與物鏡的數(shù)值孔徑應(yīng)合理匹配，物鏡的數(shù)值孔徑必須小于聚光器的數(shù)值孔徑。(2)載玻片的適宜厚度應(yīng)該在0.8-1.2mm。(3)載玻片和蓋玻片應(yīng)清潔無傷痕，否則照明光線會(huì)在其處發(fā)生漫射而影響暗視野的照明。(4)照明光源的照明強(qiáng)度要高。若照明強(qiáng)度不夠，樣品的反射光強(qiáng)度不夠，會(huì)響觀察。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法3.暗視野擋板的制作(1)選擇要觀察的物鏡(2)轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器孔徑光闌調(diào)節(jié)環(huán)，使與相應(yīng)倍數(shù)的物鏡相對應(yīng)，對標(biāo)本準(zhǔn)焦。(3)從顯微鏡上卸下聚光器，用圓規(guī)量出孔徑光闌開孔的直徑，以上測直徑在相紙上繪一圓。 (4)再測量聚光器下方濾片支架的直徑。以上測直徑在相紙上作另一同心圓。 (5)在兩圓之間繪出三條連接的支架 ，用

5、剪刀剪下兩圓，放入濾片支架中。 (6)將聚光器安裝回顯微鏡，即得該物鏡的暗視野擋板 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法(二)相差顯微鏡1.構(gòu)造原理(1)環(huán)狀光闌(2)相板a共軛面和補(bǔ)償面b吸收膜和相位膜C正（暗）反差和負(fù)（明）反差(3)合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡(4)綠色濾光片實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法2.使用方法（1）根據(jù)觀察標(biāo)本的性質(zhì)及要求，挑選適合的相差物鏡。 （2）將標(biāo)本片放到載物臺(tái)上。 （3）進(jìn)行光軸中心的調(diào)整。 （4）取下一側(cè)目鏡，換上合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，調(diào)整環(huán)狀光闌與相板上的共軛面圓環(huán)完全重疊吻合，然后取下合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，換回目鏡。在使用中，如需要更換物鏡倍數(shù)時(shí)，必須重新進(jìn)行環(huán)狀光闌與相板共軛面圓環(huán)吻合的調(diào)整。 （5）放上綠色

6、濾光片，即可進(jìn)行鏡檢，鏡檢操作與普通光學(xué)顯微鏡方法相同。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法3.使用注意事項(xiàng)（1）視場光闌與聚光器的孔徑光闌必須全部開大，而且光源要強(qiáng)。因環(huán)狀光闌遮掉大部分光，物鏡相板上共軛面又吸收大部分光。（2）環(huán)狀光闌要與相板相匹配（3）不同型號(hào)的光學(xué)部件不能互換使用。 （4）載玻片、蓋玻片的厚度應(yīng)遵循標(biāo)準(zhǔn)，不能過薄或過厚。 （5）切片不能太厚，一般以510m為宜，否則會(huì)引起其他光學(xué)現(xiàn)象，影響成像質(zhì)量。明視明視場場暗視暗視場場相差相差實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法(三)熒光顯微鏡1.構(gòu)造原理(1)光源：高壓汞燈(2)濾色鏡系統(tǒng)A激發(fā)濾色鏡B阻斷濾色鏡(3)分色鏡系統(tǒng) 二向色鏡實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法2.使用注意事項(xiàng)(1)適應(yīng)于不同的染色方法，要選擇相應(yīng)的濾色鏡和分