1、2)實驗手段(1)細(xì)胞培養(yǎng)及建立泡沫細(xì)胞模型將THP-1細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于370C, 5 CO:培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。該細(xì)胞株屬人類單核細(xì)胞系，在培養(yǎng)液中呈簇集狀懸浮生長，倍增時間大約在26 h后。細(xì)胞濃度控制在 106/mL,每兩天換液一次，每四天傳代一次。細(xì)胞復(fù)蘇 后，傳至3 = 5代后方可用于建模。(2)建立巨噬細(xì)胞模型取對數(shù)生長期的細(xì)胞，分為正常組和模型組，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL,接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mLo正常組在含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)。模型組先置于含160 nmol/L PMA的RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng)

2、72 h,貼壁后輕輕吸去上清液，PBS洗3遍，更換10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，即得巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞 的鑒定己在發(fā)表文獻中完成。(3)建立巨噬源性泡沫細(xì)胞模型將獲得的巨噬細(xì)胞更換含3%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，并加入終濃度為 80mg/L的Ox-LDL ,共同孵育48 h,油紅。染色后，鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)充滿橘紅色脂滴，即得泡沫細(xì)胞模型，此過程即為泡沫化。(4)針對CaSR的si RNA的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染根據(jù)公認(rèn)的si RNA設(shè)計原則(Nat Biotech 2004; 22: 326-330)設(shè)計針對 CaSR的3 條siRNA ,選用驗證后效果最好的一條。同時合成陽性對照

3、和陰性對照。轉(zhuǎn)染試劑選用Invitrogen 公司生產(chǎn)的 LipofectamineTM RNAiMAX Transfection ReagentosiRNA目標(biāo)序列的選取原則：工從轉(zhuǎn)錄本(mRNA)的AUG起始密碼開始，尋找'AA''二連序列，并記下其 3'端 的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。注意:GC含量在4_5 070-_5 _5%左右的siRNA 要比那些GC含量偏高的更為有效；在設(shè)計siRNA時不要針對_5'和3'端的非編碼區(qū) Cuntranslated regions UTRs),原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，

4、而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合 mRNA從而影siRNA的效果。IJ將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)J車(人.小鼠或大鼠等)進行比較，排除wwwjiebinlmnhqwHl選出合適的目標(biāo)序列進行合成.通常個基代需設(shè)計買個靶子列的siRNA,，的siRNA尖驗應(yīng)該有陰性對圾作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和途中的siRNA成F是N inkN A.沒L' L，卜的同："：.仁包中H ：卜很N、: ，_ L 卜專提以保證它和目的杷細(xì)胞中其他基田涔有同源件.平，明的疝RNA效果、 Real-rime 1,CK1)細(xì)胞總RNA提取:按Trizo

5、l試劑盒說明書進行，具體操作步驟如下：在細(xì)胞中加入冰預(yù)冷的 Trizol試劑，室溫靜置_5 min;加200 1氯仿，充分搖勻1_5sec,室溫 靜置2-3 min ; 4 0C , 12000rpm離心1 _5 min ,取上層無色水相層轉(zhuǎn)移至新EP管;加等體積異丙醇，室溫靜置l Omin 4 0C 12000rpm離心l Omin ,管壁底處可見乳白色沉淀，即為RNA;棄上清，力口 7 _5%乙醇1 ml 4 0C 7_500rpm離心_5 min ,洗滌二次；棄上層乙醇，無菌環(huán)境風(fēng)干 RNA沉淀。用20州DEPC處理的雙蒸儲水(ddH20)溶解RNA沉淀，-80 0c備用；取4川總RNA

6、加至200川滅菌水中，在紫外分光光度儀上測定其ODZo和ODZSo,計算 ODZo/ODZSo。樣品總 RNA < ug 樞 1) = OD26ox40x 稀釋彳數(shù)(50 ) /1000 o OD26o/ODZgo在1.8-2.0之間為樣品較純。2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在20川反應(yīng)體積中進彳T,成分如下 ：總RNA tug (5 JI),隨機引物1 1 DEPC處理的ddH20 4.51 70 0c冰浴l Omin;力口 10林1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(lOxbuffer 21MgCL241 dNTP21 inhibitor0.51，逆轉(zhuǎn)錄酶 11) 420C 冰浴 60min 99 0C 冰浴 _5mi

7、n-20 0C保存?zhèn)溆谩?)引物擴增設(shè)計：根據(jù)Genebank序列，設(shè)計各個引物序列并合成。4)實時定量PCR實驗方法：使用寶生物工程(大連)有限公司的SYRB. Premix ExTaqTM和Light Cycler PCR 擴增儀(Roche)進行熒光擴增；求出CT值。(6)激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)測定THP-1細(xì)胞內(nèi)游離鈣的變化取6孔板進行THP-1細(xì)胞培養(yǎng)，事先在 6孔板中加入蓋玻片。取6孔培養(yǎng)板中的蓋玻片，D Hanks液沖洗2遍，用1OOL的鈣離子探針 Fluo-3 /AM 與F-127混合工作液(10 mol/LFluo-3 /AM, 0.02070 F-127)滴于蓋玻

8、片上，370C 避光 40 min D Hanks 液再次沖洗 玻片3遍，洗去多余染料，保留少許D-Hanks液平衡細(xì)胞10 min,分組施加因素后，于10 min 內(nèi)利用LSCM進行細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度檢測。(7)油紅。染色油紅O屬于偶氮染料，是很強的脂溶劑和染脂劑，與甘油三醋結(jié)合呈小脂滴狀。 脂溶性染料能溶于組織和細(xì)胞中的脂類，它在脂類中的溶解度比在溶劑中大。當(dāng)組織切 片置人染液時，染料則離開染?而溶于組織內(nèi)的脂質(zhì)(如脂滴)中，使組織內(nèi)的脂滴呈橘紅色。細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，誘導(dǎo)建模結(jié)束后，吸去上清液，用 PBS洗三次，冰凍 的4多聚甲醛固定_5 min,PBS洗一次，再置于丙二醇中固定 _

9、5 min,輕輕吸去丙二醇，加入0. _5%油紅O的丙二醇溶液，置60c烤箱中染色1 _5 min ,用8_5%丙二醇沖洗_5 min , 再用PBS洗三次，蒸儲水清洗 1次，蘇木素復(fù)染 2-5 min 1 07oHCL分色及返藍(lán)后封片。 置顯微鏡下觀察并攝像，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)為紅色，胞核為藍(lán)色。參考文獻：Zheng XD, Li Q, Tang XB, Liang SJ, Chen LP, Zhang S, Wang ZG, Guo L, Zhang R, Zhu DL. Source of the elevationCa2+ evoked by I S-HETE in pulmonary art

10、erial myocytes. European Journal of Pharmacology 2008;601:16-22(8)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的測定細(xì)胞內(nèi)膽固醇的提?。杭?xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)結(jié)束后，吸去上清液，冰預(yù) 冷PBS洗三次，用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，加 1 mL冰預(yù)冷0.9%生理鹽水重懸細(xì)胞，反復(fù)凍 融三次，冰浴中超聲破碎_5 min,得細(xì)胞裂解液，分裝，每份 200匹，-700C貯存，用于測 定總膽固醇和游離膽固醇?？偰懝檀嫉奶崛。喝?60L上述細(xì)胞裂解液，力口 300L 15 KOH 乙醇溶液，_50 0C 水解2h,加正己烷一異丙醇 (4:1)SOOL渦漩30 s 40C下

11、3600 r/min離心_5 min,取上 層。繼用正己烷一異丙醇(4:1)如上法抽提兩次，合并三次抽提的有機相，減壓真空干燥，加20L內(nèi)標(biāo)儲備液，用甲醇并定容至 2 mL,搖勻，作為總膽固醇供試品溶液。游離膽固醇的提?。喝?60L上述細(xì)胞裂解液，加 300L乙醇，加正己烷一異丙醇(4:1)500匹渦漩30 s 40C下3600 r/min離心_5 min，取上層。繼用正己烷一異丙醇(4:1) 如上20L內(nèi)標(biāo)儲備溶解并定容至法抽提兩次，合并三次抽提的有機相，減壓真空干燥，加2mL,搖勻，作為游離膽固醇供試品溶液。HPLC測定膽固醇：色譜柱：Hypersil C 18柱（2.1 mmx150 m

12、m 3m）;流動相：甲 醇一水（90:10）;流速:0.5 mL/min;柱溫：室溫;進樣量:10 Lo參考文獻：唐朝克，王佐，易光輝，萬載陽，劉錄山，袁中華，王燕，危當(dāng)亙，阮長耿，楊永宗.Rolipram對THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出和ABCA1表達的影響.中國藥理學(xué)通報.2003oct;19（10）:1177-82（9） ELISA法檢測細(xì)胞因子的分泌情況按每孔2x1護個細(xì)胞接種于 24孔板中，含有160nmo1/L PMA的培養(yǎng)液培養(yǎng)72小 時后，PBS洗三遍，各組加入處理因素，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。從平衡至室溫的密封袋中取出實驗所需板條，留空白孔。加O.lm

13、l離心后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液于反應(yīng)孔中，置370C孵育90分鐘。然后洗板_5次。（同時做空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品空 ）。于各反應(yīng) 孔中，加入新鮮稀釋的生物素化抗體工作液0.1m1 370C孵育1小時，洗板_5次。加酶結(jié)合工作液O.lml 370C避光孵育30分鐘，洗板_5次。加入O.lml顯色底物液，370C避光孵育1 _5分鐘于各反應(yīng)孔中加入終 卜液O.lml混勻后即可測量 ODq50值。（10）Western Blot檢測蛋白表達變化1）總蛋白的提取：收集細(xì)胞，加入冰預(yù)冷的蛋白裂解液（lmmol/L PMSF pH7.4）混勻，超聲破碎細(xì)胞;4 0C 12000rpm,離心1 _5min ,取上清液，用

14、考馬斯亮藍(lán)法染 色，測定蛋白含量；取上清加入_5*上樣緩沖液（體積比4: 1） 1000C沸水中煮_5 min, -20 0C 備用。2 ） SDS-PAGE電泳:按照膠配置方法配制不同濃度PAGE膠，電泳置染料抵達分離膠底部，斷開電源，取下凝膠。切下帶有要轉(zhuǎn)移蛋白泳道的凝膠，右下角作一標(biāo)記以確定方向及正反而。3）轉(zhuǎn)膜:剪1塊與凝膠大小相同的 NC膜（不能大于凝膠），右下角作一標(biāo)記，浸 泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中，大約 _5 min o剪8塊濾紙，右下角作一標(biāo)記，其大小略與凝膠相同（不能大于凝膠）。將剪好的濾紙在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡，按陽極到陰極（從下至上）川頁序安裝轉(zhuǎn)移裝置：平放底部電極，在底部電極上放置

15、4張浸泡好的濾紙，精確對齊，將NC膜放在濾紙上，排除氣泡。把SDS-PAGE電泳凝膠轉(zhuǎn)移到去轉(zhuǎn)移緩沖液中漂洗，平 放于NC膜上，用玻棒擠出所有氣泡，在其上再放置 4張浸泡好的濾紙，排出氣泡。將 上層電極放于夾層物上，連接電源，根據(jù)凝膠而積按 1 mA/cm2接通電源。4）封17:轉(zhuǎn)移結(jié)束后，在TBS-T液內(nèi)清洗20min,加_5%脫脂奶粉，37 0c封閉lho_5） 一抗孵育：封閉結(jié)束后，用 TBS-T稀釋第一抗體，將 NC濾膜置于其中，4 0C 震蕩過夜。6）顯跡:TBS-T液漂洗NC膜3次/l Omin ,將膜與TBS-T稀釋二抗孵育，室溫下 振蕩1h; TBS-T漂洗NC膜3次/lOmi

16、n; TBS液漂NC膜3次/l Omin X光膠片上 曝光，隨后顯影、定影，用圖像分析系統(tǒng)測定蛋白條帶的光密度，進行定量分析。（11）免疫熒光技術(shù)檢測蛋白表達定位1)細(xì)胞生長貼在玻片上，細(xì)胞密度適中，大約60-7_5%滿片即可。2)取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定1 _5分鐘，現(xiàn)用現(xiàn)配。3) PBS沖洗。4) 0.107oTriton 作用 20 分鐘。5) PBS沖洗。6) 10%正常血清封閉10分鐘。：7)加入一抗，4度孵育過夜。8) PBS沖洗4次，各_5分鐘。9)加入熒光二抗，室溫 30分鐘。10) PBS沖洗4次，各_5分鐘。11) 90%甘油封片。12)避光保存，熒光顯微鏡下觀察并照相

17、記錄。3)關(guān)鍵技術(shù)(詳見:2)實驗手段)1 1) CaSR的siRNA的設(shè)計及轉(zhuǎn)染平臺的建立由于巨噬細(xì)胞是終末分化的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染相對較難。siRNA的轉(zhuǎn)染需要注意如下幾點工純化siRNA II避免RNA酶污染III避免使用抗生素 W通過看家基因作為 陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件。(2)細(xì)胞內(nèi)游離鈣的測定激光共聚焦顯微鏡用于細(xì)胞內(nèi)游離鈣的測定，由于鈣離子探針Fluo-3 /AM是熒光染料，所以處理后細(xì)胞需要避光放置，并減少各組監(jiān)測時間差，盡量消除染料自身淬而產(chǎn)生的誤差。(3)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的測定細(xì)胞內(nèi)膽固醇的測定需用高效液相色譜，對于這一設(shè)備的應(yīng)用，安靜穩(wěn)定的檢測境、恒流恒溫的流動項對于獲得可信的實驗

18、結(jié)果是必須的。膽固醇檢測所需的色譜柱Hypersil C 18柱(2.1 mmx150 mm 3m),其運行條件是：流動相：甲醇一水(90:10);流速:0.5 mL/min;柱溫:室溫；進樣量：10匹。2 .可行性分析(1)理論的可行性眾多研究業(yè)己證明，巨噬細(xì)胞的泡沫化和致炎細(xì)胞因子的過度釋放 在動脈粥樣硬化的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。我們的前期實驗結(jié)果己揭示CaSR在巨噬細(xì)胞有功能性表達，并且激活后可以促進巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的釋放?？梢?，我們的假說在理上是可行的。C2)研究方法和實驗條件的可行性本項目采用的所有實驗手段是國內(nèi)外研究中廣泛采用方法，技術(shù)十分成熟，申請者及其他主要實驗者己熟練掌握相關(guān)技術(shù)

19、。哈爾濱醫(yī)大學(xué)病生教研室及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院己具備開展本課題研究所需的實驗條件及儀器設(shè)備。(3)研究隊伍的可行性本課題組所在研究室在CaSR與心血管相關(guān)疾病的研究上居國內(nèi)外領(lǐng)先水平。到目前為 卜，我們實驗室己經(jīng)發(fā)現(xiàn) CaSR在心肌細(xì)胞、血管平滑肌胞、肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均有表達，在缺血再灌注損傷、心肌肥大、動脈粥樣硬化多種理過程中發(fā)揮重要作用。本課題組成員由具有多年分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)科研經(jīng)驗中青年學(xué)者組成，前期試驗結(jié)果己發(fā)表SCI論文多篇。（四）本項目的特色與創(chuàng)新之處。1 .本項目首次在巨噬細(xì)胞水平將動脈粥樣硬化這一病理過程與CaSR的功能聯(lián)系起來，國內(nèi)外尚未見類似報道。研究結(jié)果將從新的視角進一步動脈

20、粥樣硬化的發(fā)生機制， 為其有效防治提供新思路和新靶點。2 .本試驗采用抑制劑的應(yīng)用與siRNA技術(shù)作為平行觀察手段，為以上的結(jié)論打下夯實的基礎(chǔ)。（五）年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果。1 .年度研究計劃1） 2012年1月 2012年12月完成CaSR沉默SiRNA的構(gòu)建，并建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn) 染平臺，完成對在沉默 CaSR后THP-1源性巨噬細(xì)胞的 CaSR活性的檢測。2） 2013年1月 2013年12月完成觀察 Ox-LDL對THP-1源性巨噬細(xì)胞 CaSR 的表達和活性的影響，以及檢測CaSR的活化是否影響巨噬細(xì)胞泡沫化過程。3） 2014年1月 2014年6月觀察CaSR的活化對泡沫化巨噬細(xì)胞合成分泌細(xì)胞 因子功能的影響4） 2014年7月 2014年12月完善研究內(nèi)容，根據(jù)需要補充試驗。統(tǒng)計資料， 撰寫論文，結(jié)題。2.預(yù)期研究結(jié)果（1）研究工作將能夠比較系統(tǒng)地闡明CaSR與巨噬細(xì)胞泡沫化，以及細(xì)胞因子分泌功能之間的聯(lián)系，進一步說明CaSR與動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展之間的內(nèi)在聯(lián)系，從而為評彳t CaSR是否可以作為