1、抗生素體外及體內(nèi)抑菌效應(yīng)檢測的實(shí)驗(yàn)綜述報(bào)告1實(shí)驗(yàn)意義本綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目作為微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充和深入，選擇抗生素為實(shí)驗(yàn)材料，主要內(nèi)容包括抗生素的體外抑菌實(shí)驗(yàn)、抗生素的體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)，形成一個(gè)整體的綜合性實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容上強(qiáng)調(diào) 系統(tǒng)性、專業(yè)性、實(shí)用性和趣味性；涉及微生物學(xué)專業(yè)多項(xiàng)技術(shù) 原理、復(fù)雜流程，將整體實(shí)驗(yàn)課程的水平從分散的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)提升 到綜合性、系統(tǒng)性更高的層次，對學(xué)生的動(dòng)手能力、專業(yè)水平、 科研素質(zhì)等進(jìn)行全面的培養(yǎng)和提高，此即本項(xiàng)目設(shè)計(jì)的意義所在。2實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1) 了解常用抗菌藥物的抗菌作用及抗菌范圍，并掌握抗 菌藥物的某些體外抗菌實(shí)驗(yàn)；(2)觀察血液、細(xì)菌、藥物三者相互作用，以加深學(xué)生對 抗菌

2、藥物藥理作用的認(rèn)識；(3)通過理論聯(lián)系實(shí)際的學(xué)習(xí)和操作訓(xùn)練，訓(xùn)練學(xué)生掌握 醫(yī)學(xué)微生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)技能和實(shí)驗(yàn)技巧，提高動(dòng)手能力，有助于學(xué)生科學(xué)世界觀的形成；(4)培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立操作、分析解決問題的能力，提高對微 生物學(xué)的興趣，為學(xué)生獨(dú)立創(chuàng)業(yè)提供一些創(chuàng)業(yè)技能思路。3實(shí)驗(yàn)原理金黃色葡萄球菌是機(jī)會致病菌，而抗菌藥物在一定濃度下對 具有抑制和殺滅作用?？咕幬镆话闶侵妇哂幸志驓⒕钚缘?藥物，包括各種抗生素、磺胺類、咪嚏類、硝基咪嚏類、嘍諾酮 類等化學(xué)合成藥物。由細(xì)菌、放線菌、真菌等微生物經(jīng)培養(yǎng)而得 到的某些產(chǎn)物，或用化學(xué)半合成法制造的相同或類似的物質(zhì)，也可化學(xué)全合成。藥物的體外抑菌實(shí)驗(yàn)，是指在體外測定藥

3、物抑制或殺滅細(xì)菌 能力的實(shí)驗(yàn)。它是常用抗菌實(shí)驗(yàn)的方法，其中最常用的方法有系 列稀釋法和瓊脂擴(kuò)散法。稀釋法有液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法和固體稀釋法（斜面法）兩種，這兩種方法都可以用來測定藥物的最小抑菌濃度（MIC）:是指該藥物能抑制細(xì)菌生長的最低濃度，通常用？滋g/mL或U/mL表示。其結(jié)果判斷方法為凡無肉眼可見細(xì)菌生長的藥物最低濃度 即為該菌的最小抑菌濃度（MIC）。瓊脂擴(kuò)散法是將抗菌藥物加至接種試驗(yàn)菌的平板表面，抗菌藥物在瓊脂膠內(nèi)向四周自由擴(kuò)散， 其濃度隨擴(kuò)散距離增大而降低。 在藥物一定的擴(kuò)散距離內(nèi)，由于藥物的抗菌效應(yīng)，試驗(yàn)菌不能生 長，此無菌生長的范圍稱為抑菌圈。 抑菌圈的大小與藥物的抑菌 效應(yīng)

4、成正比。瓊脂擴(kuò)散法常有紙片法、管碟法、打洞法和挖溝法。一般藥敏實(shí)驗(yàn)常采用紙片法， 我們可以根據(jù)抑菌圈的大小， 來判 斷菌種對藥物的敏感性，是敏感，中度敏感還是耐藥。藥物的體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)又稱為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)治療試驗(yàn)或保護(hù)力試 驗(yàn)。當(dāng)抗菌藥物進(jìn)入機(jī)體后，其效力的發(fā)揮要受體內(nèi)各種因素的 影響。如血液及組織內(nèi)的蛋白質(zhì)或磷脂、 濃汁內(nèi)的核酸均與藥物 結(jié)合，降低藥物的活性；壞死組織內(nèi)的酸性環(huán)境也能影響藥物的 活性。機(jī)體內(nèi)的微生物代謝活動(dòng)較低，對藥物的敏感性降低，有 時(shí)還可以形成細(xì)胞壁缺陷型細(xì)菌， 對某些藥物不敏感。機(jī)體內(nèi)各 組織中藥物的吸收、分布不同，使藥物的濃度難以恒定。因此在 評定新藥的藥效時(shí)除做體外抑菌實(shí)驗(yàn)

5、外還需要做體內(nèi)的抗菌實(shí) 驗(yàn)。4實(shí)驗(yàn)操作4.1 實(shí)驗(yàn)材料與用品材料：宿主（兔、雞等）經(jīng)抗凝處理后血液全血組分，人工 培養(yǎng)的人單核巨噬細(xì)胞 U937 ,金黃色葡萄球菌209-P （或*5 ） 標(biāo)準(zhǔn)株。器材：滅菌EP管（EP管），EP管架，新鮮全血，槍頭（黃、 白、藍(lán)），微量移液器（10?滋L, 100?滋L, 1mL）,滅菌小棉 簽，小鏡子，圓形濾紙（直徑為 6 mm）,培養(yǎng)皿，紫外分光光度 計(jì)，電熱恒溫培養(yǎng)箱，恒溫振蕩培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)板。藥品與試劑：青霉素，鏈霉素，四環(huán)素，氯霉素，紅霉素，碘酊，檸檬酸鈉，75%酉精，PBS緩沖液。4.2 培養(yǎng)基的制備(1) TSB+agar培養(yǎng)基：胰蛋白大豆肉湯粉

6、末 30.0g, NaCl 30.0g,蒸儲水1000mL, pH 7.2,瓊脂20.0g,溶化后分裝，121c 滅菌15min備用。(2) TSB肉湯培養(yǎng)基：胰蛋白大豆肉湯粉末30.0g, NaCl30.0g,蒸儲水 1000mL, pH 7.2, 121c 滅菌 15min 備用。4.3 抗菌藥物的體外抑菌實(shí)驗(yàn)4.3.1 試管法(1)取滅菌EP管10只，按1-10編號，排列于EP管架上。 無菌操作，分別加入TSB肉湯培養(yǎng)基0.5mL。用微量移液器吸取 40U/mL的青霉素藥液0.5mL放入第1管，并反復(fù)吸勻。從第1 管吸出0.5mL放入第2管，吸勻后吸出0.5mL放入第3管，依 此法逐管進(jìn)

7、行稀釋至第 9管。第10管不加藥液作為對照管。(2)各EP管加入0.5mL新鮮配置的稀釋濃度為10-4的金 黃色葡萄球菌209-P菌液，放入孵箱內(nèi)于37c孵育24h后取出， 覲察細(xì)菌生長情況并將結(jié)果記錄于表中。細(xì)菌不生長的最小濃度 為青霉素對金黃色葡萄球菌的 MIC。(3)其余抗菌藥物均按上述方法測定對金黃色葡萄球菌209-P 的 MIC。4.3.2 紙片法(1)以滅菌小棉簽麻取金黃色葡萄球菌液，在管壁上旋轉(zhuǎn) 擠壓幾次，去掉過多的菌液，然后輕輕地從4個(gè)不同方向平行交 叉劃線，使菌液均勻涂布于整個(gè)瓊脂平板表面。(2)取2000U/mL的青霉素、2000以g/mL的鏈霉素、四環(huán) 素、氯霉素、紅霉素

8、、2.5%勺碘酉X各2 mL分裝于試管中。用無菌 小鏡子取圓形濾紙12張，每兩張浸于同一種藥液中，浸透后取 出，瀝去過多的藥液。將2片含一種藥液的濾紙分別放在已接種 細(xì)菌的瓊脂平板表面的不同區(qū)域。為了位置間隔準(zhǔn)確，最好事先在皿底用標(biāo)記筆做上記號。(3)將培養(yǎng)皿放入孵箱內(nèi)于 37c孵育24 h,觀察紙片周圍 有無抑菌圈，將結(jié)果記錄于表中。測量抑菌圈的直徑，比較各藥 的抗菌效力。4.4 抗菌藥物的體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)4.4.1 接種法及細(xì)菌存活測試4.4.2 色葡萄球菌各菌株劃線至TSB + agar平板上培養(yǎng)16h;4.4.3 上挑取多個(gè)克隆到含有 PBS的EP管中，離心收集 菌，用PBS洗滌兩遍后調(diào)菌

9、液濃度至吸光度 OD600=0.6 ,稀釋 100倍后取100?滋L菌液和lmL全血混合37c搖床培養(yǎng)。(3)分別在 0h, 1h, 3h, 5h, 7h, 9h 時(shí)間點(diǎn)取 100?滋 L 混合培養(yǎng)液，用無菌水稀釋 10倍、100倍、1000倍涂平板，放 置37C培養(yǎng)20 h后，計(jì)數(shù)生長出來的細(xì)菌克隆數(shù)，以 0 h的克 隆數(shù)作為對照，計(jì)算存活率，作圖。4.4.4 抗生素醴內(nèi)治療干預(yù)實(shí)驗(yàn)(1)依據(jù)步驟4.3.1體外抗菌實(shí)驗(yàn)的得到的各抗生素的最小 抑菌濃度值，配制各種常用抗生素合適濃度的母液。(2)金黃色葡萄球菌各菌株劃線至TSB+agar平板上培養(yǎng)16h;(3)從板上挑取多個(gè)克隆到含有 PBS的

10、EP管中，離心收集 菌，用PBS洗滌兩遍后調(diào)菌液濃度至吸光度 OD600=0.6 ,稀釋 100倍后取100?滋L菌液和l mL全血混合，再加入工作濃度的 各種抗生素，37 C搖床培養(yǎng)。(4)分別在 0h, 1h, 3h, 5h, 7h, 9h 時(shí)間點(diǎn)取 100?滋 L 混合培養(yǎng)液，用無菌水稀釋 10倍、100倍、1000倍涂平板，放 置37C培養(yǎng)20 h后，計(jì)數(shù)生長出來的細(xì)菌克隆數(shù)，以 0 h的克 隆數(shù)作為對照，計(jì)算存活率，作圖。5注意事項(xiàng)(1)充分滅菌的槍頭和 EP管應(yīng)當(dāng)烘干后使用，避免槍頭和 EP管中殘余的水株對稀釋結(jié)果產(chǎn)生影響。(2)菌液稀釋時(shí)，確保正確使用移液器，確保吸取的菌液體積正確。(3)用移液槍吸取較為粘稠的血液時(shí)， 動(dòng)作應(yīng)當(dāng)輕柔緩慢， 以免血液進(jìn)入槍管，影響移液槍使用。(4)使用滅菌小棉簽麻取金黃色葡萄球菌液涂布瓊脂平板表面時(shí)，棉簽麻取菌液后應(yīng)當(dāng)在 EP管壁上碾壓一下，避免涂布 后在平板上留下過多菌液，長成較厚菌苔進(jìn)而影響后期抑菌圈觀 察。(5)菌液涂布時(shí)，應(yīng)當(dāng)在平板上均勻涂布，避免留下空白 區(qū)域，影響抑菌圈大小測定。(6)在進(jìn)行紙片法測定抑菌效果時(shí)，