1、高效液相色譜質(zhì)譜法快速鑒定復(fù)方毛冬青沖劑中三萜皂苷活性成分You never know what you can do till you. We are here to add what we can to life, not to get what we can from it. 作者：楊運(yùn)云郭鵬然陳怡祿鄧六勤鐘鳴吳慶暉【摘要】建立了高效液相色譜質(zhì)譜法(HPLCMS)快速鑒定復(fù)方毛冬青沖劑中三萜皂苷活性成分的方法。以甲醇為萃取劑超聲萃取復(fù)方毛冬青沖劑30min。采用高效液相色譜離子阱質(zhì)譜(HPLCITMS)和高效液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLCTOFMS)對(duì)萃取液進(jìn)行分析，選用AgilentZ

2、orbaxEclipseXDBC18色譜柱(250mm4.6mm,5m)，以水(含0.1%甲酸)乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，柱后流出液采用電噴霧離子阱質(zhì)譜(ESIITMS)和電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESITOFMS)的正、負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)離子阱一級(jí)質(zhì)譜(ITMS1)、離子阱二級(jí)質(zhì)譜(ITMS2)和分析時(shí)間質(zhì)譜(TOFMS)信息分析，并與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比較，鑒定出1種三萜酸和8種三萜皂苷成分，并推測(cè)了其它3種可能的三萜皂苷化學(xué)成分，通過(guò)對(duì)照品對(duì)比分析，三萜酸確證為IlexgeninA，其中一種三萜皂苷確證為IlexsaponinA1()。本方法無(wú)需對(duì)照品即可快速有效地鑒定出復(fù)方毛冬青沖

3、劑中的三萜皂苷活性成分，為建立沖劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】復(fù)方毛冬青沖劑，三萜皂苷，高效液相色譜質(zhì)譜1引言Time is money, but money is not time. 毛冬青(Radixilicispubescentis)為冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬植物毛冬青(IlexpubescensHook.etAm.)的干燥根，是我國(guó)南方常用中藥，已有多種成方制劑如毛冬青膠囊、毛冬青注射液、復(fù)方毛冬青氯貝酸鋁片和復(fù)方毛冬青沖劑等收載于部頒標(biāo)準(zhǔn),主要用于治療循環(huán)系統(tǒng)疾病，有擴(kuò)張血管及抗菌消炎的功效1。Early mistakes are the seeds of fu

4、ture trouble. 目前，市售毛冬青品種混亂，化學(xué)成分和藥理作用差別較大，從而導(dǎo)致了毛冬青制劑的質(zhì)量難以控制。因此，建立快速、有效地監(jiān)測(cè)毛冬青制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的方法十分必要。已報(bào)道的毛冬青的主要化學(xué)成分有齊墩果烷型和烏索烷型三萜酸及皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、木脂素類(lèi)、酚酸類(lèi)、脂肪酸和糖脂類(lèi)等化合物210。其中IlexosideO2，IlexgeninA3，IlexsaponinA13，IlexsaponinB7,B14,B24,B34,B45和IlexsaponinC5,6等三萜酸和三萜皂苷被認(rèn)為是其主要活性成分。復(fù)方毛冬青沖劑由毛冬青、板藍(lán)根和大青葉3味中藥材經(jīng)適宜工藝制成，三萜酸和三萜皂苷仍為沖

5、劑的主要活性成分(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )。由于沖劑中糖類(lèi)輔料等基體物質(zhì)的含量很高，且三萜皂苷化合物的紫外吸收很弱，要通過(guò)高效液相色譜紫外檢測(cè)(HPLCUV)或高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)(HPLCDAD)測(cè)定其含量非常困難，并且還需要價(jià)格昂貴的對(duì)照品。HPLCMS檢測(cè)三萜皂苷類(lèi)物質(zhì)靈敏度很高，并能在線提供每個(gè)譜峰的分子量和結(jié)構(gòu)信息，在不需要對(duì)照品的情況下，可以快速鑒定出復(fù)方毛冬青沖劑中的三萜酸和三萜皂苷活性成分，是沖劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和指紋圖譜建立的有效手段之一。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器與試劑 1100HPLCMSTrapXCT高效液相色譜離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司);1200HPLCMST

6、OF高效液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司);ZorbaxEclipseXDBC18高效液相色譜柱(250mm4.6mm,5m，美國(guó)Agilent公司)。復(fù)方毛冬青沖劑(廣州市兒童醫(yī)院);甲醇和乙腈均為色譜純(美國(guó)Burdick&Jackson公司)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由超純水設(shè)備(美國(guó)MiliQ公司)制備。2.2實(shí)驗(yàn)步驟Know thyself. 3結(jié)果與討論Good counsel never comes too late. 3.1HPLCMS分析結(jié)果三萜皂苷類(lèi)化合物ESIMS正、負(fù)離子模式下的離子化效果均很理想。圖1為復(fù)方毛冬青沖劑萃取液的HPLCITMS正、負(fù)離子全掃描

7、質(zhì)量色譜圖。文獻(xiàn)10報(bào)道毛冬青藥材反相C18柱HPLC圖譜有兩個(gè)指紋區(qū)。一個(gè)區(qū)的保留較弱(保留時(shí)間tR較短)，在245320nm有紫外吸收，主要為木酯素類(lèi)化合物;另外一個(gè)區(qū)的保留較強(qiáng)(tR較長(zhǎng))，波長(zhǎng)210nm以上無(wú)明顯紫外吸收，低含量用HPLC法測(cè)定非常困難，主要為三萜酸和三萜皂苷類(lèi)化合物。本研究所得HPLCMS圖譜與文獻(xiàn)10類(lèi)似，tR33min為三萜酸和三萜皂苷類(lèi)化合物的指紋區(qū)。圖1復(fù)方毛冬青沖劑萃取液的正離子(A)和負(fù)離子(B)HPLCITMS全掃描質(zhì)量色譜圖Fig.1LiquidchromatogramsobtainedbyTICfrompositive(A)andnegative(B

8、)iontrap(IT)MSofcompoundRadixilicispubescentismedicinalgranules3.2三萜皂苷化合物的鑒定文獻(xiàn)報(bào)道毛冬青中所含的三萜酸和三萜皂苷類(lèi)化合物多以毛冬青酸(Ilexolicacid)，IlexgeninA，IlexgeninB和IlexgeninC為苷元27，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2。A faithful friend is hard to find. 分析復(fù)方毛冬青沖劑HPLCMS色譜圖中每個(gè)譜峰的ITMS1，ITMS2和TOFMS信息，并與已報(bào)道的毛冬青中鑒定出來(lái)的三萜皂苷活性物質(zhì)進(jìn)行比較，鑒定出1種三萜酸和8種三萜皂苷化合物，并推測(cè)了

9、其它3種可能的三萜皂苷化學(xué)成分，色譜峰如圖1所示。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下采用HPLCITMS分析IlexgeninA和IlexsaponinA1對(duì)照品，通過(guò)比較保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，色譜峰8確證為IlexsaponinA1，色譜峰12確證為IlexgeninA。Quality is better than quantity. 色譜峰1:tR=35.5min;TOFMS：m/z1092.5951M+NH4+(誤差：0.0002)，1073.5543M-H-(誤差：0.0005)，分子式C53H86O22，M=1074.5611;ITMS1：m/z1097M+Na+，1092M+NH4+，913M+H-

10、Glc+，455M+H-H2O-Glc-XylGlcRha+，437M+H-2H2O-Glc-XylGlcRha+，1119M+HCOO-，1109M+Cl-，1073M-H-;ITMS2：m/z935M+Na-Glc+，911M-H-Glc-,765M-H-Glc-Rha-，603M-H-Glc-GlcRha-;通過(guò)與文獻(xiàn)2比較，鑒定為IlexosideO。The peacock has fair feathers, but foul. 圖2毛冬青中已經(jīng)鑒定的三萜酸和三萜皂苷化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.2Chemicalstructuresoftriterpeneandsaponinsident

11、ifiedinRadixilicispubescentis色譜峰2:tR=37.2min;TOF-MS：m/z946.5358M+NH4+(誤差：-0.0012)，927.4962M-H-(誤差：0.0003)，分子式C47H76O18，M=928.5032;ITMS1：m/z951M+Na+，946M+NH4+，767M+H-Glc+，455M+H-H2OGlc-XylGlc+，437M+H-2H2O-Glc-XylGlc+，973M+HCOO-，963M+Cl-，927M-H-;ITMS2：m/z789M+Na-Glc+，765M-H-Glc-,603M-H-Glc-Glc-;通過(guò)與文獻(xiàn)4

12、比較，鑒定為IlexsaponinB3。If you run after two heares, you will ca. 色譜峰3:tR=39.5min;TOFMS：m/z805.4356M+Na+(誤差：0.0011)，827.4424M+HCOO-(誤差：-0.0011)，分子式C41H66O14，M=782.4453;ITMS1：m/z805M+Na+，471M+H-H2O-Glc-Xyl+，453M+H-2H2O-Glc-Xyl+，437M+H-3H2O-Glc-Xyl+，827M+HCOO-，817M+Cl-;ITMS2：m/z643M+Na-Glc+，619M-H-Glc-;通過(guò)

13、與文獻(xiàn)5,6比較，鑒定為IlexsaponinC。色譜峰4:tR=40.3min;TOFMS：m/z844.4676M+NH4+(誤差：-0.0013)，871.4432M+HCOO-(誤差：-0.0001)，分子式C42H66O16，M=826.4351;ITMS1：m/z849M+Na+，844M+NH4+，665M+H-Glc+，503M+H-2Glc+，485M+H-H2O-2Glc+，467M+H-2H2O-2Glc+，421M+H-2H2O-HCOOH-2Glc+，871M+HCOO-，861M+Cl-，825M-H-;ITMS2：m/z503，485，467，421，663M-H

14、-Glc-，501M-H-2Glc-;推測(cè)可能為IlexgeninA與2個(gè)葡萄糖形成的三萜皂苷。色譜峰5:tR=41.8min;TOFMS：m/z784.4844M+NH4+(誤差：0.0002)，811.4488M+HCOO-(誤差：0.0003)，分子式C41H66O13，M=766.4503;ITMS1：m/z789M+Na+，784M+NH4+，455M+H-H2O-XylGlc+，437M+H-2H2O-XylGlc+，811M+HCOO-，801M+Cl-，765M-H-;ITMS2：m/z627M+Na-Glc+，455，437，603M-H-Glc-;通過(guò)與文獻(xiàn)4比較，鑒定為I

15、lexsaponinB1。色譜峰6:tR=44.6min;TOFMS：m/z935.5002M+Na+(誤差：0.0027)，957.5057M+HCOO-(誤差：-0.0008)，分子式C47H76O17，M=912.5083;ITMS1：m/z935M+Na+，930M+NH4+，455M+H-H2O-XylGlcRha+，437M+H-2H2O-XylGlcRha+，957M+HCOO-，947M+Cl-，911M-H-;ITMS2：m/z789M+Na-Rha+，765M-H-Rha-，603M-H-GlcRha-;通過(guò)與文獻(xiàn)4比較，鑒定為IlexsaponinB2。論文分為專(zhuān)題型、論

16、辯型、綜述型和綜合型四大類(lèi) 色譜峰7:tR=45.2min;TOFMS：m/z916.5277M+NH4+(誤差：0.0007)，943.4891M+HCOO-(誤差：-0.0012)，分子式C46H74O17，M=898.4926;ITMS1：m/z921M+Na+，916M+NH4+，455M+H-H2O-XylGlcAra+，437M+H-2H2O-XylGlcAra+，943M+HCOO-，933M+Cl-，897M-H-;ITMS2：m/z789M+Na-Ara+，765M-H-Ara-;通過(guò)與文獻(xiàn)5比較，鑒定為IlexsaponinB4。色譜峰8:tR=45.9min;TOFMS：

17、m/z682.4152M+NH4+(誤差：-0.0009)，663.3751M-H-(誤差：0.0001)，分子式C36H56O11，M=664.3823;ITMS1：m/z682M+NH4+，503M+H-Glc+，485M+H-H2O-Glc+，467M+H-2H2O-Glc+，457M+H-HCOOH-Glc+，439M+H-H2O-HCOOH-Glc+，421M+H-2H2O-HCOOH-2Glc+，663M-H-;IT-MS2：m/z503，485，467，457，439，421，663，501M-HGlc-;通過(guò)與文獻(xiàn)3比較，鑒定為IlexsaponinA1，并在相同的實(shí)驗(yàn)條件下通

18、過(guò)對(duì)照品進(jìn)行了確證。色譜峰9：tR=47.8min;TOFMS：m/z912.5039M+NH4+(誤差：-0.0006)，939.4952M+HCOO-(誤差：-0.0007)，分子式C47H76O16，M=894.4977;ITMS1：m/z917M+Na+，912M+NH4+，437M+H-H2O-Xyl-Glc-Rha+，939M+HCOO-，929M+Cl-，893M-H-;ITMS2：m/z771M+Na-Rha+，437，747M-H-Rha-;推測(cè)可能為Ilexolicacid與一個(gè)鼠李糖、一個(gè)葡萄糖和一個(gè)木糖形成的三萜皂苷。色譜峰10：tR=48.8min;TOFMS：m/z

19、603.3896M-H-(誤差：-0.0006)，分子式C35H56O8，M=604.3975;ITMS1：m/z622M+NH4+，455M+H-H2O-Xyl+，437M+H-2H2O-Xyl+，603M-H-;ITMS2：m/z455，437，471M-H-Xyl-;推測(cè)可能為IlexgeninB與一個(gè)木糖形成的三萜皂苷。Money is the root of all evil. 色譜峰11：tR=49.5min;TOFMS：m/z766.4741M+NH4+(誤差：0.0005)，分子式C41H64O12，M=748.4398;ITMS1：m/z771M+Na+，766M+NH4+，

20、437M+H-H2O-XylGlc+，793M+HCOO-，783M+Cl-，747M-H-;ITMS2：m/z609M+Na-Glc+，437，585M-H-Glc-;通過(guò)與文獻(xiàn)7比較，鑒定為IlexsaponinB。It is right to put everything in its proper use. 色譜峰12：tR=52.0min;TOFMS：m/z503.3363M+H+(誤差：-0.0004)，501.3228M-H-(誤差：0.0006)，分子式C30H46O6，M=502.3294;ITMS1：m/z503M+H+，485M+H-H2O+，467M+H-2H2O+，4

21、57M+H-HCOOH+，439M+H-H2O-HCOOH+，421M+H-2H2O-HCOOH+，501M-H-;ITMS2：m/z485，467，457，439，421，483M-H-H2O-，465M-H-2H2O-，455M-H-HCOOH-，437M-H-H2O-HCOOH-，419M-H-2H2O-HCOOH-;通過(guò)與文獻(xiàn)3比較，鑒定為IlexgeninA，并在相同的實(shí)驗(yàn)條件下通過(guò)對(duì)照品進(jìn)行了確證。 3.3三萜皂苷化合物ESIMS特征質(zhì)譜規(guī)律 表1對(duì)以Ilexolicacid，IlexgeninA，IlexgeninB和IlexgeninC為苷元的三萜酸和三萜皂苷化合物ESIMS特

22、征質(zhì)譜規(guī)律進(jìn)行了總結(jié)，其ESIMS除了可以檢測(cè)到m/zM+Na+，M+NH4+，M-H-，M+Cl-，M+HCOO-特征峰以外，正離子ESIMS1還有非常明顯的特征碎片峰，詳細(xì)特征峰如下：Ilexolicacid苷元m/z437;IlexgeninA苷元m/z503，485，467，457，439，421;IlexgeninB苷元m/z455，437;IlexgeninC苷元m/z471，453，435。IlexsaponinA，B和C三萜皂苷的正、負(fù)ESIMS2表1毛冬青中三萜酸和三萜皂苷的ESIMS質(zhì)譜特征峰We are here to add what we can to life, n

23、ot to get what we can from it. M+HCOO-M+Na-糖苷(indican)+M-H-糖苷(indican)-均可檢測(cè)到失去一個(gè)或多個(gè)糖苷的特征碎片峰，通常情況下，-162為失去一個(gè)葡萄糖或半乳糖苷，-146為失去一個(gè)鼠李糖苷，-132為失去一個(gè)木糖或阿拉伯糖苷。這些規(guī)律可用于快速推測(cè)復(fù)方毛冬青沖劑或毛冬青藥材中其它可能存在的三萜皂苷，為新的三萜皂苷化合物鑒定提供理論依據(jù)。【參考文獻(xiàn)】1XiongYouXiang(熊友香),LiChang(李昶),LuoXianTang(羅憲堂).J.ChineseMed.Mat.(中藥材),2002,25(5):3713742HanYN,HanBH,BaikSK,KimTH.U.S.Patent,4987125,19913KazayukiH,MiyokoI,YokoM,