1、土貝母皂苷體外抗乙型肝炎病毒的藥效研究(1)        作者：周艷萌， 吳中明， 向曉波 【關鍵詞】 土貝母皂苷；,2215細胞；,乙型肝炎病毒；,體外摘要：目的觀察土貝母皂苷體外抗乙型肝炎病毒(HBV)效果。方法以2215細胞為靶細胞，給藥后通過檢測細胞表面及培養(yǎng)液中HBsAg，HBeAg和HBVDNA，觀察土貝母皂苷抗HBV效果。結果土貝母皂苷各濃度組對HBsAg，HBeAg表達均有抑制作用，但以0.1 mg/ml作用48 h時最強，分別為43.46%和54.52%（P<0.01）；對HBVDNA的抑

2、制作用以1 mg/ml組顯著（P<0.05）。結論土貝母皂苷在體外有抗乙型肝炎病毒(HBV)作用。關鍵詞：土貝母皂苷； 2215細胞； 乙型肝炎病毒； 體外Abstract：ObjectiveTo study the effect of antiHBV activity in vitroMethodsThe antiHBV activity of Tubeimoside was observed in 2215cells(human hepatocellular carcinoma cells stably transfected with HBV)ResultsTubeimoside

3、could significantly reduce HBsAg、HBeAg level. After 48 hours of continuous exposure to Tubeimoside at the concentration of 0.1mg/ml in vitro culture, the inhibitions of HBsAg，HBeAg were 43.46 ，54.52 respectively(P<0.01). While the inhibitions of HBV DNA is significant at the concentration of 1mg/

4、ml in vitro culture.ConclusionThe antiHBV effect of Tubeimoside is demonstrated in 2215 cellsKey words：Tubeimoside； 2215 cells； HBV； In vitro     乙型肝炎是由嗜肝DNA病毒（Hepatitis B virus,HBV）引起的一種世界范圍內(nèi)的傳染性疾病。目前全世界約有3億多人為慢性HBV 感染，我國約占半數(shù)。受HBV慢性感染的人群罹患肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC

5、）的相對危險性至少增加100倍，并最終導致死亡，給人們的健康造成極大的威脅和損害。因此，尋求高效低毒的抗HBV的天然藥物已成為刻不容緩的問題1，2。土貝母含有多種化學成分，具有抗腫瘤、抗病毒、免疫抑制等多種藥理作用3。陳英俊等4曾用土貝母加入九三三肝泰丸中治療乙型肝炎208例，總有效率為93.4%，說明土貝母在治療乙肝的復方中起到了一定的作用，但土貝母是否具有抗HBV的作用國內(nèi)外尚未見報道。為了觀察土貝母皂苷對乙型肝炎病毒是否有影響，我們用HBV基因轉染的人肝癌細胞系（HepG2）的2.2.15細胞體外培養(yǎng)作工具，檢測土貝母皂苷在體外對乙型肝炎病毒的作用?，F(xiàn)將實驗結果報告如下。1 .材料與方法

6、1.1 材料2.2.15細胞系HBV（adw亞型）基因轉染的人肝腫瘤細胞株，購于武漢細胞保藏中心。土貝母皂苷為白色粉末（購自西安鴻生生物技術有限公司，批號：030816），4保存。拉米夫定（3TC），葛蘭素威康（蘇州）制藥有限公司產(chǎn)品。MTT、RNAse、羊抗人IgGFITC和ELISA試劑盒購自北京華美生物工程公司。HBVDNA熒光定量PCR檢測試劑盒購自深圳匹基生物工程公司。1.2 方法 1.2.1 細胞培養(yǎng)及藥物作用 細胞培養(yǎng)方法按文獻5操作。待細胞長滿培養(yǎng)瓶后，用0.25%胰酶消化成單個，配成1×105個細胞/ml，轉接種于6孔、96孔培養(yǎng)板及25 ml培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)4 d后

7、換含不同濃度（10，5，1，0.1，0.01 mg/ml）的土貝母皂苷培養(yǎng)液，分別作用24，48，72 h。每24 h換液1次，共培養(yǎng)72 h，換出的上清及收集的細胞置20保存?zhèn)錅y。以相同條件不含藥物培養(yǎng)液和陽性對照藥物(拉米夫定)培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞作為對照?？瞻卓撞患蛹毎患优囵B(yǎng)液。1.2.2 藥物對細胞的毒性實驗用MTT比色分析法6檢測細胞吸光度值，與相應對照孔的吸光度值（存活細胞100）比較，按公式計算存活細胞的百分比，對細胞毒性進行動態(tài)觀察。細胞存活率=（實驗孔OD值/對照孔OD值）×100。1.2.3 藥物對2.2.15細胞HBsAg，HBeAg和HBcAg的影響細胞爬片：

8、用間接免疫熒光法7進行染色，于熒光顯微鏡下觀察，以胞膜或核膜呈黃綠色熒光者為陽性。流式細胞儀（FACS Calibur）檢測：上機前細胞懸液用PBS液200 ml重懸，F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)出黃綠色熒光，設定氬離子激發(fā)光源為488 nm，用Cell Quest軟件采集細胞20000個再進行數(shù)據(jù)分析，以單參數(shù)直方圖表示。1.2.4 藥物作用后細胞培養(yǎng)上清中HBsAg，HBeAg和HBVDNA的檢測HBsAg、HBeAg的檢測：用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA法）分別檢測每孔HBsAg，HBeAg的P/N值，操作按試劑盒說明書進行，根據(jù)公式計算抑制率：某藥對HBsAg或HBeAg的抑制率=（對照組平均P

9、/N藥物處理組平均P/N）/對照    組平均P/N×1008上清中HBVDNA的檢測：實時熒光定量PCR法操作按試劑盒說明書進行，結果以Ct值表示。 1.3 統(tǒng)計學處理采用 SPSS10.0軟件，配對t檢驗。2 結果2.1 藥物的細胞毒性實驗在加入不同濃度的土貝母皂苷和3TC作用24，48 h及72 h后，用顯微鏡觀察細胞病變，72 h內(nèi)土貝母皂苷1 ，0.1 mg/ml及0.01 mg/ml和3TC各組細胞形態(tài)與對照組無明顯差別；土貝母皂苷10 mg/ml和5 mg/ml組作用至48 h細胞內(nèi)空泡明顯增大，細胞腫脹，72 h部分細胞破裂死亡

10、。加入MTT液和DMSO溶解甲瓚顆粒后，測OD值并計算細胞存活率。結果見表1。土貝母皂苷各濃度組與對照組相比，在0.01 mg/ml濃度下實驗組與對照組間差異無顯著性，提示在該濃度下其對2.2.15細胞生長無毒性作用；在1 mg/ml及0.1 mg/ml濃度下，48 h內(nèi)對細胞無毒性作用，當時間延長則對細胞產(chǎn)生毒性作用（P<0.05）。在同一時間內(nèi)，隨著土貝母皂苷濃度增加，細胞存活率下降，說明其對細胞的毒性也在增加。3TC在50 mg/ml濃度下72 h內(nèi)未見明顯細胞毒性。表1 土貝母皂苷、3TC在2.2.15細胞培養(yǎng)中對細胞的毒性（略）與細胞對照組比較，*P<0.05, cP<0.01；n=42.2 免疫熒光法觀察藥物對2.2.15細胞HBsAg，HBeAg和HBcAg的影響2.2.1 細胞爬片免疫熒光染色法鏡下熒