1、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)分析三七和海兔神經(jīng)連索內(nèi)的皂甙組分 11-04-22 15:23:00 編輯：studa20 作者：馮麗劍 黃琳 卓慧欽 黃河清【摘要】 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間（MALDITOF）質(zhì)譜技術(shù)能高效解吸三七提取液（Panaxnotoginseng Extraction, PNE）中的混合皂甙分子為皂甙離子，并供質(zhì)量分析器檢測(cè)與分析。選用MALDITOF 質(zhì)譜技術(shù)直接分析色譜純?cè)磉皹悠返募兌?，其檢測(cè)靈敏度優(yōu)于反相高效液相色譜法（RPHPLC）。優(yōu)化提取中藥三七(Panax notoginseng, PN)的混合皂甙, 選用MALDITOF質(zhì)譜技術(shù)直接分析PN

2、E中的皂甙種類和相對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)PNE至少含有20種不同分子結(jié)構(gòu)的皂甙組分，其中人參皂甙(Ginsenoside) Rg1和三七皂甙（Notoginsenoside）R1含量相對(duì)較高。選用薄板層析法（TLC）制備PNE中的R1皂甙。MALDITOF質(zhì)譜技術(shù)研究藍(lán)斑背肛海兔(Notarcus leachiicirrosus Stimpson, NLCS)神經(jīng)連索內(nèi)的超微量R1的組成與分布。建立PNE皂甙的指紋圖譜，并適合于評(píng)價(jià)中藥三七的品質(zhì)和分析體內(nèi)超微量皂甙的代謝過(guò)程與機(jī)理。 【關(guān)鍵詞】 三七，皂甙，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，指紋圖譜1 引言 人參(Ginsenoside)和三七(Pan

3、ax notoginseng)是常用的名貴中藥材之一，主要用于治療各種出血瘀血之癥以及跌打損傷，瘀滯腫痛，具有止血不留瘀和增強(qiáng)免疫力等獨(dú)特功效1,2。皂甙是三七藥材中的重要活性成分，由人參皂甙Rb1， Rg1， Re和三七皂甙R1組成2。近年來(lái), PNS在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面和藥理學(xué)研究已引起重視。三七皂甙（Panax notoginseng saponins, PNS）不僅具有增強(qiáng)記憶功能3，而且還是治療許多神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的神經(jīng)元死亡和記憶衰退等有效阻斷劑4。有關(guān)PNS的藥理尚不清楚，僅有少量的研究報(bào)道3，5，推測(cè)與目前尚未建立高效、高靈敏度且能連續(xù)監(jiān)測(cè)的皂甙成分的分析技術(shù)有關(guān)。 目前，

4、已從三七的不同部位中分離出二十幾種皂甙，其中多數(shù)皂甙與人參皂甙的成分相同，即為達(dá)瑪烷型的20(S)原人參二醇型20 (S) protopanaxadiol，如：Rb1， Rb2， Rc， Rd等組分；20(S)原人參三醇型20 (S)peotopanaxatriol，如：Re， Rf， Rg1， Rg1， Rh1等組分，其中Rg1和Rb1含量最高6，7。除人參皂甙組分以外，PNS也含有三七皂甙，如: R1， R2， R4， R6， Fa， Fc， Fe等組分8,9，其中R1的含量相對(duì)較高。有關(guān)皂甙R1的藥效和藥理學(xué)的研究也甚少。 采用柱層析法、高效液相色譜蒸發(fā)光散射法10、薄層層析法、液滴逆流

5、層析法、氣相色譜、高效液相色譜11和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)12，分離與鑒定色譜純的人參和三七皂甙的分子結(jié)構(gòu)與組成已見報(bào)道，但對(duì)制備質(zhì)譜純的皂甙單體且用于藥物療效的研究甚少，從而限制了深入研究皂甙藥理學(xué)和皂甙免疫增強(qiáng)機(jī)理。 MALDITOF質(zhì)譜分析技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)單、高靈敏度和高分辨率等特點(diǎn)，但用于直接分析皂甙分子結(jié)構(gòu)與組成的研究報(bào)道也甚少。本研究采用MALDITOF質(zhì)譜技術(shù)直接分析PNE和海兔神經(jīng)連索內(nèi)的皂甙組成和相對(duì)含量，本方法適合評(píng)價(jià)三七的藥材品質(zhì)、皂甙藥效和體內(nèi)代謝途徑與機(jī)理。2 實(shí)驗(yàn)部分 2.1 儀器與試劑 REFLEX 型MALDITOF質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruker公司）； 1100型高效色譜儀（

6、美國(guó)Agilent公司）；GENESYSZ型紫外可見分光光度計(jì)（美國(guó)Water公司）； LABCONCO Fezone 18凍干機(jī)（美國(guó)Labconco公司）。 三氟乙酸（TFA）和乙腈(HPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司)； 胰蛋白酶（V5111，Promega公司); 基質(zhì)； 氰4羥肉桂酸（HCCA，美國(guó)ICN生物醫(yī)學(xué)公司）。2.2 標(biāo)準(zhǔn)人參皂甙和三七皂甙提取與分離 用超純水分別配制0.1 g/L人參皂甙Rg1， Rb1， Re標(biāo)準(zhǔn)溶液。 以0.1 mg三七皂甙R1混合溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品。取三七粉末0.6 g，加入乙醇50 mL，放置過(guò)夜，置80 水浴上保持微沸至乙醇揮發(fā)干凈，再加入50 mL超

7、純水溶解樣品。按照文獻(xiàn)1,的HPLC方法分離與鑒定三七提取液中的皂甙成分與含量，制備色譜純的皂甙單體。以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，在012 min，以019% A進(jìn)行梯度分離；在1260 min，以19%36% A進(jìn)行梯度分離。檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。2.3 薄層層析分離板制備 取三七粉末0.5 g，加水5滴，攪勻。再加以水飽和的正丁醇5 mL，振搖10 min，放置2 h，離心，取上清液。加用正丁醇飽和的水3倍量，搖勻，放置使分層。取正丁醇層，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試液。取人參皂甙Rb1， Rg1， Re和三七皂甙R1加甲醇制成2.5 g/L的混合液，作為對(duì)照

8、液。分別取供試品和對(duì)照液10 L，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，冷風(fēng)吹干。置于盛有展開劑的層析缸內(nèi)展開，待展開劑的前沿距離硅膠板底部約1 cm，取出，揮干溶劑，均勻噴乙醇顯色劑后，在105 加熱10 min顯色鑒定。 TLC展開劑為V(氯仿)V(甲醇)V(水)=53510混合溶液; 乙醇顯色劑為V()V(乙醇) =19混合溶液; 水飽和的正丁醇：取過(guò)量水加入正丁醇溶液中充分振蕩，靜置使其分層，取上層; 正丁醇飽和的水：取過(guò)量水加入正丁醇溶液中充分振蕩，靜置使其分層，取下層。 2.4 海兔神經(jīng)連索中的內(nèi)含物提取 按2.3節(jié)描述的方法制備三七的R1組分。海兔給藥（R1）方式和海兔神經(jīng)連索分離的方法均參見

9、文獻(xiàn)1。海兔神經(jīng)連索內(nèi)的多肽與皂甙組分均參見文獻(xiàn)1,1。2.5 質(zhì)譜分析 質(zhì)譜基質(zhì)配制 50 mmol/L 氰4羥肉桂酸（HCCA）/40%乙腈/60%的0.1%三氟乙酸水溶液：40 L ACN60 L 0.1% TFA，加入足量的氰4羥肉桂酸，配成HCCA飽和溶液，然后超聲處理5 min，8000 g離心5 min，取上清液使用，每次新鮮配制。 MALDITOF 質(zhì)譜分析 吸取待分析樣品0.8 與等體積基質(zhì)均勻混合、點(diǎn)樣，作質(zhì)譜分析。質(zhì)譜條件：脈沖氮激光（337 nm）作為離子解吸電離源。選用反射模式，離子源加速電壓1為20 kV，加速電壓2為23 kV，脈沖3 ns，離子延遲2000 ns

10、，真空度114 107Torr為分析基本條件。平均每次測(cè)定樣品的激光脈沖次數(shù)約120次。采用外標(biāo)法標(biāo)定多肽質(zhì)譜峰峰位1。 HPLCQTOF質(zhì)譜分析 選用HPLCQTOF質(zhì)譜儀測(cè)定三七皂甙提取液中的混合樣品組分，佐證MALDITOF質(zhì)譜技術(shù)鑒定PNE皂甙組成。3 結(jié)果與討論3.1 RPHPLC技術(shù)鑒定皂甙標(biāo)樣的純度 選用RPHPLC技術(shù)分離皂甙標(biāo)樣Rb1， R1， Re和Rg1，擬了解皂甙標(biāo)樣是否已達(dá)到色譜純純度的要求，并獲得圖1結(jié)果。由圖1可見，皂甙標(biāo)樣Rb1， R1和Re均達(dá)到較高的色譜純度，而Rg1含有微量的雜皂甙（圖1a1）。收集色譜純?cè)磉皹?biāo)樣，供定性和半定量分析中藥三七內(nèi)的皂甙組成和相

11、對(duì)含量。圖1 RPHPLC技術(shù)分離皂甙標(biāo)樣的色譜圖（略）Fig.1 Chromatogram maps of standard saponin samples separated with RPHPLCa Rg1樣品(amples); b R1 樣品(ample); c Re 樣品(ample); d Rb1 樣品(ample)。圖2 MALDITOF MS技術(shù)分析皂甙標(biāo)樣的質(zhì)譜圖（略）Fig.2 Mass spectra of standard saponins samples analyzed with MALDITOF MSa. Rg1 樣品(sample); b. R1 樣品(sample); c. Re 樣品(sample); d. R