1、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備及動(dòng)力學(xué)研究馮清華 00711120 周二【摘要】谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(glutathione SGST與GSH之間的這種特異性作用，運(yùn)用親和層析從兔肝中提取純化GST。繼而通過(guò)蛋白含量以及酶活力的測(cè)定，計(jì)算GST的比活力，進(jìn)行相關(guān)的動(dòng)力學(xué)研究?！娟P(guān)鍵詞】GST 酶動(dòng)力學(xué) 親和層析 米氏方程 考馬斯亮藍(lán)G-250法【引言】GST是機(jī)體內(nèi)廣泛參與芳香環(huán)氧化物、過(guò)氧化物和鹵化物的解毒作用的重要的同工酶家族。本實(shí)驗(yàn)首先將對(duì)酶進(jìn)行分離純化，方法是采用親和層析從兔肝提取液中純化得到GST，親和層析中使用的配基為GST的底物GSH。以含有金屬螯合劑、還原劑等的平衡緩沖液BufferA除去雜蛋

2、白，一方面有強(qiáng)的離子洗脫強(qiáng)度，一方面又能保持目的蛋白的活性；繼而使用含有GSH的BufferB洗脫GST目的蛋白。在酶動(dòng)力學(xué)研究中，采用1氯2,4二硝基苯(CDNB)和還原型谷胱甘肽(GSH)作為酶的底物，以分光光度法記錄酶促反應(yīng)生成產(chǎn)物GSDNB 引起的光吸收增加值，在338nm處連續(xù)測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)物吸光值變化，可作出A338nm -t曲線，計(jì)算酶活力。如上利用反應(yīng)，在酶和底物反應(yīng)達(dá)到預(yù)定的1min時(shí)，立即加入強(qiáng)酸終止酶促反應(yīng)。測(cè)定光吸收增加值，計(jì)算這段時(shí)間內(nèi)反應(yīng)的平均速度并近似替代反應(yīng)初速度，通過(guò)作圖法求出米氏方程的兩個(gè)參數(shù)Km 和V。最后用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，利用其在

3、酸性溶液中自然呈現(xiàn)棕紅色，而與蛋白質(zhì)疏水結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，最大吸光值從465nm移到595nm處的原理，可通過(guò)測(cè)量其在595nm處的吸光度增量，即可測(cè)定蛋白質(zhì)含量。再根據(jù)酶活力和蛋白質(zhì)含量求出勻漿液與酶液的比活力，通過(guò)計(jì)算總活力的回收率、比活力的提高倍數(shù)，評(píng)價(jià)GST 的提純效果，進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)問(wèn)題的相關(guān)探討。1. 材料與方法1.1試劑與材料：Buffer A：0.025mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH7.4，含3mmol/L DTT，1mmol/L EDTA，0.2mol/L NaCl；Buffer B: 0.025mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH7.4，含3mmol/L GSH，2mmol/L DT

4、T：60mmol/L GSH (重蒸水溶解)；0.1mol/L PB (pH 6.5)200ml；50% TCA；60mmol/L CDNB：500g/mL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液；考馬斯亮藍(lán)G-250溶液10ml兔肝勻漿液，Sepharose 4B-GSH1.2實(shí)驗(yàn)儀器1.5cmX10cm層析柱，核酸-蛋白紫外檢測(cè)儀，可見分光光度計(jì)，移液槍，注射器，秒表，紫外分光光度計(jì)，便攜式記錄儀，比色杯1.3實(shí)驗(yàn)步驟親和層析法純化谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶垂直柱體，放入大漏斗，保持凝膠上洗脫溶液體積與凝膠體積比為2：1，攪拌中將凝膠均勻連續(xù)倒入柱體，沉降23min后，開下出口，滴速56s/滴；至柱床高23cm時(shí)，停止裝柱。連

5、接蛋白檢測(cè)系統(tǒng)，用Buffer A平衡（約10-20mL），至記錄儀基線平穩(wěn)。取4g兔肝，剪碎，加入約10倍組織重的Buffer A，用組織搗碎機(jī)勻漿；勻漿液先用10000r/min離心10min，棄沉淀，上清再次離心（4°C，100000r/min，40min），棄沉淀，濾紙過(guò)濾上清液，稱量體積。將濾液上柱，流速約34秒1滴，透過(guò)峰量體積。用Buffer A洗去雜蛋白至柱中介質(zhì)變白，記錄儀回到基線。用Buffer B洗脫，流速約34秒1滴，收集洗脫峰（約5mL），混勻并量體積，分裝成兩管冷凍。調(diào)整紫外分光光度計(jì)的參數(shù)：Wavelength:338nm，Delay Time:30s，

6、Cycles:8。樣品1：兔肝勻漿液；樣品2：上樣透過(guò)液；樣品3：洗脫峰（酶液）調(diào)節(jié)加入樣品的量使得A338nm/min 在0.20.5 之間。實(shí)驗(yàn)中按下表1.1 加樣操作?？瞻讟悠?樣品2樣品30.1mol/L PB(pH6.5)/mL2.92.92.92.960mmol/L CDNB/L5050505060mmol/L GSH/L50505050將空白和樣品比色皿中的溶液混勻，放入分光光度計(jì)校零樣品溶液/L0282加入酶同時(shí)按“run”，立即混勻，進(jìn)行反應(yīng)表1.1兩個(gè)比色杯分別加入PB 、底物CDNB和GSH（60 mmol/L），混勻；放在分光光度計(jì)中的空白和“1”位上，注意光路方向，按

7、“zero base”，等待儀器校零；將“1”位上的比色杯拿出，加入待測(cè)溶液的同時(shí)按“run”，立即混勻，放入分光光度計(jì)中；儀器自動(dòng)讀8個(gè)數(shù)（30s讀一次），共反應(yīng)4 min。分別做出時(shí)間吸光值關(guān)系曲線，過(guò)原點(diǎn)做切線，求出A340nm/min值；利用公式求出酶活力，其中V為酶促反應(yīng)體積(3mL)，為產(chǎn)物的消光系數(shù)9.6L/(mmolcm)，L為比色杯的光程(1cm)。根據(jù)樣品溶液的蛋白質(zhì)含量和測(cè)定酶活力時(shí)所用的樣品溶液體積，計(jì)算出測(cè)定酶活力所用蛋白質(zhì)的量，進(jìn)而計(jì)算出兔肝勻漿液和酶液的比活力，并比較親和層析的總活力回收及比活力的提高倍數(shù)。取6支試管，按下表1.2加樣，利用酶液（樣品3）測(cè)定的Km

8、和V。(酶液體積為A340nm/min=0.4時(shí)的酶量。)0123452 mmol/L GSH/mL00.150.300.601.202.40GSH濃度00.050.10.20.40.860 mmol/L CDNB/L5050505050500.1 mol/L PB/mL2.852.702.552.251.650.45酶液/L333333反應(yīng)1 min后加入50%的TCA 100 L終止反應(yīng)A340nm/min00.1610.1280.2640.2210.268表1.2每根試管加入CDNB、GSH（2mmol/L）、PB混勻后，加入酶，同時(shí)用秒表計(jì)時(shí)，立即混勻，靜置，1分鐘時(shí)加入50%的TCA

9、，立即混勻，終止反應(yīng)；將儀器 delay time調(diào)為0，cycles調(diào)為1，空白同酶活性測(cè)定，用0試管溶液放在“1”位上校零，測(cè)定其他各管的吸光值。計(jì)算出各種作圖法需要的數(shù)據(jù)，用幾種直線方法作圖（雙倒數(shù)，Hanes-Woolf和Eisenthal和Cornish-Bowden 作圖法），根據(jù)橫、縱截距求出米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度。S = GSH（3mL反應(yīng)體系中的底物濃度）；1/S = 1/ GSH；1/ v = / A340nm；S/v = GSH/v在微量反應(yīng)板中按下表1.3平行操作，每個(gè)點(diǎn)做兩個(gè)平行孔。（勻漿液已稀釋十倍）標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品微孔編號(hào)1234567(酶液)8(勻漿液標(biāo)準(zhǔn)蛋白液/L

10、024681033蛋白含量/g01.02.03.04.05.0-去離子水/L2018161412101717Bradford /L200200200200200200200200每加入一孔Bradford試劑用槍頭輕輕吸吹23次，使反應(yīng)溶液混合均勻，全部加完后，室溫放置5分鐘，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值。A630nm(1)0.6430.7230.8360.8810.9111.0230.8660.939A630nm(2)0.6060.7160.8310.9230.9701.0070.8660.929A630nm(3)0.6150.7360.8040.8990.9740.9850.7940.888A630

11、nm(4)0.6220.7130.8170.9050.9340.9930.8160.793A630nm (平均值)0.6220.7220.8220.9020.9471.0020.8360.887表1.3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：每一點(diǎn)吸光值取平均值，并扣除空白管的吸光值，以其為縱坐標(biāo)，每管標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（g）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；計(jì)算勻漿液和酶液的蛋白質(zhì)濃度：用待測(cè)樣品溶液的吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)含量，根據(jù)實(shí)驗(yàn)中所加入的樣品體積計(jì)算出蛋白質(zhì)濃度（g/mL或mg/mL）；計(jì)算2個(gè)樣品的比活力：根據(jù)樣品溶液的蛋白質(zhì)含量和測(cè)定酶活力時(shí)所用的樣品體積，計(jì)算出測(cè)定酶活力所用蛋白質(zhì)的量，進(jìn)而計(jì)算出兔肝

12、勻漿液和酶液的比活力。比較親和層析的總活力回收及比活力的提高倍數(shù)。2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1 親和層析親和層析圖譜見該頁(yè)背面。2.2 測(cè)定酶活力A338nm/min0s30s60s90s120s150s180s210s240s樣品30.0000.1540.2910.4180.5300.6300.7210.8090.898樣品20.0000.1830.3370.4810.6030.7160.8170.9181.008樣品10.0000.2730.4970.6870.8621.0091.1441.2561.361表2.1樣品1：兔肝勻漿液；樣品2：上樣透過(guò)液；樣品3：洗脫峰（酶液）時(shí)間-吸光值關(guān)系曲線圖

13、2.1時(shí)間-吸光值關(guān)系曲線圖2.2時(shí)間-吸光值關(guān)系曲線圖2.32.3 計(jì)算比活力蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2.4得擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = -0.0089x2 + 0.1221x + 0.611數(shù)據(jù)總表:兔肝勻漿液透過(guò)峰洗脫峰(GSTs酶液)A340nm/ min0.5500.3700.310樣品溶液總體積/mL15222.8測(cè)定酶活力樣品體積/L282酶活力/IU0.17190.11560.0969蛋白質(zhì)含量/(mg/mL)0.980.73比活力/(IU/mg蛋白質(zhì))0.008770.0664總活力/IU1.31550.1859比活力提高倍數(shù)7.57總活力回收率/%14.13表2.22.4 測(cè)定酶

14、促反應(yīng)的米氏常數(shù)Km及最大速率V（取0.1，0.4，0.8處三組數(shù)據(jù)）1/S （= 1/ GSH）1/ v （= / A340nm） S（= GSH）v/S（= v/GSH）v（=A340nm/）10750.10.1330.01332.543.440.40.05750.02301.2535.820.80.03490.0279表2.3雙倒數(shù)做圖法：圖2.5Km=-1/（-31.328/4.3836）=0.1399mol/LV=1/31.328=0.0319mol/（L·min）Eadie-Hofstee作圖法：圖2.6Km=0.1437mol/LV=0.0322mol/（Lmin）3.

15、 討論3.1 親和層析GST親和層析色譜圖中有一條干擾的曲線，是由于調(diào)整靈敏度和基線過(guò)程沒(méi)有抬筆造成的，對(duì)透過(guò)液和洗脫液的收集沒(méi)有影響。洗脫峰后出現(xiàn)了兩個(gè)小峰，這可能是由于GST本身就是一組同工酶，或者是由體系的不穩(wěn)定性造成的。雜蛋白收集峰的強(qiáng)度遠(yuǎn)大于GST洗脫峰強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)中控制收集透過(guò)液靈敏度2A，收集洗脫液變?yōu)?.2A，是為了得到高窄、尖銳的洗脫峰以準(zhǔn)確確定洗脫液收集的起止點(diǎn)，有助于得到較純、濃度較高的洗脫液。在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該控制流速也十分重要，適當(dāng)放慢流速，有助于GST充分吸附與洗脫。3.2酶活力的測(cè)定使用終止法測(cè)定米氏常數(shù)時(shí)，必須保證所有反應(yīng)在進(jìn)行了相同時(shí)間之后立即終止，因此打入TCA 的時(shí)候一定要?jiǎng)幼餮杆伲ＷC各個(gè)試管平行性。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中第三組即沒(méi)有及時(shí)加入TCA，舍去了這個(gè)數(shù)據(jù)，考慮到本來(lái)只有5 組數(shù)據(jù)，這樣的損失是很大的。另外，加入0.1mL TCA 的量也要盡量準(zhǔn)確，因?yàn)榧尤胍后w的差別會(huì)導(dǎo)致整