1、細(xì)胞外ATP對(duì)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響(一)    作者：錢軍，馬延超，夏亞一，漢華，孫正義 【摘要】 目的 研究細(xì)胞外ATP對(duì)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響。方法 健康成年Wistar大鼠20只，雌雄不限，體重280-320g，平均300g，制作成脊髓打擊傷動(dòng)物模型，并隨機(jī)分為兩組：A組(ATP組)和B組(對(duì)照組)，每組10只。傷后1、3、7、14、28d用改良的Tarlov 評(píng)分、斜板試驗(yàn)觀察大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。 結(jié)果 大鼠脊髓損傷后A組改良的Tarlov 評(píng)分、斜板試驗(yàn)優(yōu)于對(duì)照組，在14d和28d，改良的Tarlov 評(píng)分、斜板試驗(yàn)A

2、組明顯優(yōu)于B組(P0.05)。結(jié)論 細(xì)胞外ATP能促進(jìn)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。 【關(guān)鍵詞】 脊髓損傷；ATP；運(yùn)動(dòng)功能；大鼠脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)時(shí)機(jī)體歷經(jīng)原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷的序貫過程，造成不同程度的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的壞死、凋亡，軸突的斷裂、脫髓鞘，臨床表現(xiàn)為損傷平面以下不同程度的感覺、運(yùn)動(dòng)和大小便功能障礙。脊髓損傷后功能恢復(fù)的核心機(jī)制被認(rèn)為是啟動(dòng)了潛伏的突觸和神經(jīng)環(huán)路以及殘存的神經(jīng)元軸突側(cè)支發(fā)芽，并和靶細(xì)胞形成新突觸，從而實(shí)現(xiàn)神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)重組1。因此，脊髓損傷后，提高神經(jīng)元的存活質(zhì)量，促進(jìn)神經(jīng)元軸突的生長是恢復(fù)脊髓功能的關(guān)鍵。ATP作為一種價(jià)格

3、低廉、安全性高的傳統(tǒng)能量物質(zhì)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用已經(jīng)引起了國內(nèi)外學(xué)者們的重視。最近的研究表明，細(xì)胞外ATP具有保護(hù)脊髓神經(jīng)元的作用，并能促進(jìn)外周神經(jīng)再生軸突生長、成熟2。對(duì)于細(xì)胞外ATP對(duì)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響，未見文獻(xiàn)報(bào)道，本文通過行為學(xué)檢查，觀察細(xì)胞外ATP對(duì)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響。1 材料與方法1.1 動(dòng)物分組健康成年Wistar大鼠(蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)20只，雌雄不限，體重280-320g，平均300g，制作成脊髓打擊傷動(dòng)物模型，并隨機(jī)分為兩組：A組(ATP組)和B組(對(duì)照組)，每組10只。1.2 脊髓損傷動(dòng)物模型的制作方法用100g/L(10%)水合氯醛腹腔注射

4、麻醉，俯臥位固定，取后正中切口，顯露椎板及棘突，明確T10棘突后咬除T9-11棘突、T10全部椎板和T9、T11上、下各半個(gè)椎板，Allen 法用自制打擊器制作脊髓打擊傷動(dòng)物模型，打擊強(qiáng)度為30gcf，造模成功后，逐層縫合切口。造模成功的標(biāo)志：在Allen 裝置撞擊脊髓的瞬間，動(dòng)物身體抖動(dòng)，雙下肢迅速發(fā)生回縮及彈動(dòng)動(dòng)作，尾巴痙攣性搖動(dòng)，表明撞擊成功。術(shù)后大鼠自由進(jìn)食、飲水，控制室溫在18-22，定時(shí)清潔籠具，每天擠壓膀胱排尿2-3 次，直至膀胱功能恢復(fù)。1.3 給藥方法A組動(dòng)物在打擊完成后，經(jīng)暴露的硬脊膜注射ATP(5mg/kg)至硬脊膜下?lián)p傷周圍組織，縫合傷口后即經(jīng)腹腔注射ATP(40mg/

5、kg)，以后每天經(jīng)腹腔注射同等劑量的ATP 1次；B組動(dòng)物注射方法同A組，給予等量的生理鹽水作為對(duì)照治療。1.4 行為學(xué)檢查A、B兩組動(dòng)物分別于傷后1、3、7、14、28d行改良的Tarlov 評(píng)分、斜板試驗(yàn)，對(duì)大鼠進(jìn)行行為及肢體運(yùn)動(dòng)功能檢測，觀察傷后各時(shí)相點(diǎn)大鼠后肢活動(dòng)、肌力等，以此評(píng)定ATP處理前后大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。改良的Tarlov 評(píng)分：0分，沒有自主性運(yùn)動(dòng)；1 分，僅限于髖、膝關(guān)節(jié)的非反射性運(yùn)動(dòng)；2分，肢體髖、膝、踝3個(gè)主要關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)；3分，能主動(dòng)支持體重和不協(xié)調(diào)步態(tài)，或偶爾出現(xiàn)協(xié)調(diào)步態(tài)；4分，前肢和后肢協(xié)調(diào)的步態(tài)，行走時(shí)有趾間關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)；5分，正常步態(tài)3。斜板實(shí)驗(yàn)：采用Riv

6、lin法4，將大鼠放置于一長方形木制斜板上，上面墊一橡膠墊，斜板可旋轉(zhuǎn)測量斜板角度。將大鼠身體縱軸與斜板縱軸平行放置，大鼠頭朝斜板抬高側(cè)，以再抬高5°時(shí)大鼠能停留5s的最大角度為測定值，每只動(dòng)物測5次，取其平均值作為測定值。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以±s表示，應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，LSD 法進(jìn)行兩兩比較；組間比較采用兩樣本的t檢驗(yàn)，以P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果兩組大鼠脊髓損傷后1d改良的Tarlov 評(píng)分、斜板試驗(yàn)最低，3d后開始升高，7-14d升高較快，A組大鼠損傷后14d改良的Tarlov評(píng)分、斜板試驗(yàn)明顯

7、高于損傷后7d(P均小于0.01)，B組大鼠損傷后14d改良的Tarlov評(píng)分也明顯高于損傷后7d(P0.05)，兩組大鼠改良的Tarlov 評(píng)分、斜板試驗(yàn)均在損傷后28d達(dá)到高峰。損傷后1、3、7d兩組大鼠改良的Tarlov評(píng)分、斜板試驗(yàn)無明顯差別，A 組和B 組大鼠都表現(xiàn)為雙后肢不同程度的癱瘓。在損傷后14d和28d，改良的Tarlov 評(píng)分A組明顯高于B組 (P均小于0.05)；斜板試驗(yàn)A組也明顯高于B組(P均小于0.05)，兩組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能都得到了不同程度的恢復(fù)，且 A 組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)明顯好于B組。見表1、表2。表1 脊髓損傷大鼠改良的Tarlov評(píng)分結(jié)果（略）表2 脊髓損傷大

8、鼠斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）3 討 論脊髓損傷后，提高神經(jīng)元的存活質(zhì)量、促進(jìn)神經(jīng)元軸突的再生是恢復(fù)脊髓功能的關(guān)鍵，而受損神經(jīng)元的存活及軸突的再生受內(nèi)外環(huán)境多種因素的影響。近年來，細(xì)胞外ATP對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用逐漸引起學(xué)者們的重視。ATP是體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)，參與體內(nèi)的多種生理、病理過程，細(xì)胞內(nèi)ATP是經(jīng)典的供能物質(zhì)，而細(xì)胞外ATP 則是功能復(fù)雜的信號(hào)分子。在神經(jīng)系統(tǒng)中，ATP可作為神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)和神經(jīng)營養(yǎng)因子作用于神經(jīng)元、各種膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、分化、增殖、凋亡、損傷和再生過程5。研究表明，細(xì)胞外ATP 是通過其受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的。ATP受體屬于嘌呤能受體，根據(jù)受體對(duì)配體的敏

9、感性不同，P受體可分為P1和P2，其中P1受體主要介導(dǎo)腺苷和AMP 的作用，屬于G蛋白偶聯(lián)受體；P2受體則主要介導(dǎo)ATP和ADP的作用，按其藥理學(xué)和分子結(jié)構(gòu)的不同，P2受體可以被分為P2x受體和P2y受體兩種類型。P2x受體屬于配體門控性非選擇性陽離子通道受體，主要分布在脊髓背根神經(jīng)節(jié)的小細(xì)胞及感覺神經(jīng)末梢，其功能主要與感覺傳導(dǎo)、尤其是與疼痛的產(chǎn)生、傳導(dǎo)有關(guān)；P2y受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體，主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及某些腺上皮細(xì)胞，與這些細(xì)胞的增殖、分化及功能活動(dòng)密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察到兩組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能在損傷后28d均得到了不同程度的恢復(fù)，ATP組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能

10、在損傷后14、28d明顯好于對(duì)照組，表明成年大鼠脊髓損傷后仍存在一定的再生能力，細(xì)胞外ATP能促進(jìn)大鼠脊髓損傷后的這種再生，從而促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。大鼠脊髓損傷后即使未經(jīng)治療，缺損的神經(jīng)功能也可逐漸恢復(fù)，提示脊髓損傷后神經(jīng)功能缺損存在著一定程度的自我恢復(fù)，即脊髓的神經(jīng)功能也存在著一定的可塑性，推測大鼠脊髓損傷后的這種神經(jīng)功能可塑性除了與脊髓損傷后水腫消退有關(guān)以外，殘存脊髓組織的結(jié)構(gòu)可塑性也起了重要作用，其機(jī)制可能是損傷區(qū)或其周圍區(qū)域殘留的神經(jīng)元軸突殘端出芽或側(cè)支出芽，并延伸至相應(yīng)的靶細(xì)胞，形成突觸聯(lián)系，重建相應(yīng)的神經(jīng)環(huán)路，從而恢復(fù)或部分恢復(fù)了對(duì)靶細(xì)胞的神經(jīng)支配。有研究表明，損傷的脊髓若能保

11、留10%的軸突，就可重建部分神經(jīng)環(huán)路，使損傷脊髓的功能有所恢復(fù)；脊髓錐體束中的神經(jīng)纖維保留10%以上，該側(cè)肢體肌肉就可有2/5以上的功能6。ATP在脊髓損傷修復(fù)過程中能促進(jìn)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，其作用機(jī)制可能是多方面的，既有直接作用，又有間接作用，但最終是通過其受體發(fā)揮作用的。推測ATP 的作用類似于一種神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors, NTFs)，作用于神經(jīng)細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體，引起細(xì)胞內(nèi)的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明，核苷酸類物質(zhì)不僅可直接作用于神經(jīng)元，也可刺激膠質(zhì)細(xì)胞合成和分泌NGF、NT3等神經(jīng)營養(yǎng)因子并與其起協(xié)同作用7。另外，

12、在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，細(xì)胞外ATP 通過受體還可以發(fā)揮促進(jìn)血液循環(huán)的作用，并能促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞特別是星形膠質(zhì)細(xì)胞的再生，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用8。細(xì)胞外ATP還具有生長因子的作用，能促進(jìn)某些DNA、蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)細(xì)胞增殖等，具有生長因子的一些特性9?？傊?xì)胞外ATP 能促進(jìn)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，其作用機(jī)制可能是多途徑的，細(xì)胞外ATP除了對(duì)于神經(jīng)元的直接作用以外，對(duì)于神經(jīng)再生局部的膠質(zhì)細(xì)胞也能發(fā)揮作用，從而改變了軸突再生的局部微環(huán)境，而血供的增加， 也會(huì)對(duì)軸突再生發(fā)揮作用。此外，ATP 在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物腺苷二磷酸、腺苷一磷酸和腺苷都有傳遞信息的作用，后者可作用于P1嘌呤能受體，并通過cA

13、MP、IP3等信息傳導(dǎo)通路影響神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，但ATP究竟是如何從分子水平促進(jìn)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)的，尚需進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1張紹文,王栓科,王翠芳，等. 慢性壓迫性脊髓損傷后神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖情況 J. 中華創(chuàng)傷雜志, 2004, 20:402405.2王栓科,洪光祥,王同光，等. 細(xì)胞外ATP防治失神經(jīng)肌肉萎縮的實(shí)驗(yàn)研究 J. 中華手外科雜志, 2002,18:4345.3王民，王棟琪，宋煥瑾. 脊髓損傷后大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)不同評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的比較 J. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2006, 27(3):243245.4Rivlin AS, Tator CH. Object

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