1、畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述生物工程e 淀粉酶的研究及應(yīng)用淀粉酶是一種水解酶，是目前發(fā)酵工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的一類(lèi)酶。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖原等“-1,4-葡聚糖，水解a-1,4-糖昔鍵的酶。根據(jù)作用的方式可分為“-淀粉酶(EC.)與伊淀粉酶(EC.)。因a-淀粉酶作用于淀粉時(shí)從淀粉分子的內(nèi)部隨機(jī)切開(kāi)a-1,4糖昔鍵，生成糊精和還原糖，而伊淀粉酶從非還原性末端逐次以麥芽糖為單位切斷生1,4-葡聚糖鏈生成分子量比較大的極限糊精，且a-淀粉酶分布更廣泛，已是一種十分重要的酶制劑，a-淀粉酶大量應(yīng)用于糧食加工、食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵、和醫(yī)藥行業(yè)等，它占了整個(gè)酶制劑市場(chǎng)份額

2、的25%左右1。目前工業(yè)生產(chǎn)上都以微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)a-淀粉酶。但隨著社會(huì)需求的增大，工業(yè)生產(chǎn)對(duì)a-淀粉酶的需求量也越來(lái)越大，急需尋找滿(mǎn)足生產(chǎn)需要的具新型特征的酶制劑。因此本文主要討論以a-淀粉酶為代表的淀粉酶的研究及應(yīng)用。1%-淀粉酶的研究1.11.1a-a-淀粉酶分離純化方法的研究高純度a-淀粉酶是一種重要的水解淀粉類(lèi)酶制劑， 可用于研究酶反應(yīng)機(jī)理和測(cè)定生化反應(yīng)平衡常數(shù)等。 分離純化a-淀粉酶的方法很多，一般都是依據(jù)酶分子的大小、形狀、電荷性質(zhì)、溶解度、穩(wěn)定性、專(zhuān)一性結(jié)合位點(diǎn)等性質(zhì)建立的。要得到高純度的a-淀粉酶，往往需要將各種方法聯(lián)合使用。鹽析沉淀、凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、疏水作

3、用層析、親和層析和電泳等，是蛋白質(zhì)分離純化的主要方法。用吸附樹(shù)脂法、40%乙醇從a-淀粉酶發(fā)酵液中分離高活性a-淀粉酶，用離子交換法和透析法對(duì)初酶液進(jìn)行脫鹽處理，最后用DEAE纖維素純化淀粉酶，所彳#酶活力為60153U/g,酶活性回收率為66.04%2。另通過(guò)乙醇沉淀、離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析等方式，從白曲霉菌A.kawachii的米曲粗抽出液中，分離純化到兩個(gè)耐酸性”-淀粉酶比活性極高的組分。用疏水吸附法和DEAE-cellulose(二乙氨基乙基-纖維素)柱層析法分離純化體淀粉酶，所得酶活力為110000U/g。用硫酸鏤沉淀和垂直板制備凝膠電泳對(duì)地衣芽抱桿菌A.4041耐高溫”-淀粉酶

4、進(jìn)行分離純化，得到3種電泳均一的組分。通過(guò)超濾、濃縮、脫鹽和聚丙烯酰胺垂直板凝膠電泳，對(duì)利用基因工程菌生產(chǎn)的重組超耐熱耐酸性生淀粉酶進(jìn)行純化，得到電泳純級(jí)的超耐熱耐酸性”-淀粉酶，純化倍數(shù)為11.7,活力回收率為29.8%3。但上述方法存在的共同問(wèn)題是，連續(xù)操作和規(guī)模放大都比較困難。雙水相技術(shù)具有處理容量大、能耗低、易連續(xù)化操作和工程放大等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用雙水相系統(tǒng)PEG/磷酸鹽分離純化笫淀粉酶，增加PEG濃度有助于酶富集上相。同樣用PEG/磷酸鹽雙水相體系從發(fā)酵液中直接萃取分離低溫”-淀粉酶，分配系數(shù)及回收率分別為4.8和87%4。PVP（聚乙烯口比咯烷酮）和硫酸鏤對(duì)酶活力具有保護(hù)作用，利用PVP

5、/硫酸鏤液-固萃取體系分離提取耐高溫生淀粉酶，酶活力回收率高，體系成相時(shí)間短，操作時(shí)不需雙水相體系所用的分液漏斗和離心操作，用傾液法即可實(shí)現(xiàn)相分離，因此，與雙水相體系相比，液-固萃取體系具有更大的優(yōu)越性5。1.21.2- -淀粉酶活力測(cè)定方法的研究測(cè)定a-淀粉酶活力的方法已不少于200種，其共同之處是，被測(cè)樣品與某種多糖底物溶液保溫反應(yīng)后測(cè)之，很難標(biāo)準(zhǔn)化。碘-淀粉比色法測(cè)定生淀粉酶活力的優(yōu)點(diǎn)是，操作簡(jiǎn)便，試劑便宜，比色精確、敏感。因此，成為受推薦的淀粉酶活力測(cè)定方法。盛勤芳6提出要提高糖化型淀粉酶活力測(cè)定的準(zhǔn)確性須注意酶反應(yīng)時(shí)間的選擇和酶的控制。嚴(yán)控制測(cè)定時(shí)間十分重要，為了保證10min內(nèi)（初

6、速度時(shí)間范圍內(nèi)）50C,底物（淀粉液）必須預(yù)保溫5-10min。為了能得到準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，對(duì)空白與樣品滴定值之差（B-A）一般控制在1.0-2.6ml;若（B-A）小于1.0ml,表明酶濃度過(guò)??；若（B-A）大于2.6ml,表明酶濃度偏高。（B-A）這個(gè)值可以通過(guò)調(diào)整酶的稀釋倍數(shù)，使之控制在1.0-2.6ml范圍內(nèi)。1.31.3 耐高溫a-淀粉酶的研究大多數(shù)淀粉酶生產(chǎn)的研究是以25-37C78的溫度范圍的中溫菌開(kāi)展的。但是為了節(jié)約生產(chǎn)成本，a-淀粉酶最好在高溫糊化（100-110C）和液化（80-90C）過(guò)程中保持活性，因此有必要尋找耐更高溫度的耐高溫a-淀粉酶。生產(chǎn)耐高溫生淀粉

7、酶的菌種有地衣芽抱桿菌、枯草桿菌、嗜熱脂肪芽抱桿菌、凝聚芽抱桿菌、酸熱芽抱桿菌以及普通高溫放線(xiàn)菌等。解淀粉芽抱桿菌、枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌和嗜熱脂肪芽抱桿菌是最常用在溫度37-60C網(wǎng)生產(chǎn)淀粉酶的芽抱桿菌。海洋紅嗜熱鹽菌，作為一種海洋嗜熱菌產(chǎn)生a-淀粉酶最高耐熱溫度為61c【劃。用隨機(jī)整合法在地衣芽抱桿菌中表達(dá)了耐高溫a-淀粉酶基因，篩選出的陽(yáng)性菌中生淀粉酶基因表達(dá)水平比供體菌提高了20倍11。對(duì)超嗜熱菌強(qiáng)烈火球菌的0t淀粉酶PFA基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化在巴斯德畢赤酵母中高效表達(dá)，得到生淀粉酶活力最高為220U/L12。耐酸性 a-a-淀粉酶的研究目前，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)中常用的淀粉酶為中溫、高溫

8、以及堿性生淀粉酶，在酸性條件下，其酶活性降低很明顯，甚至失去活性。隨著我國(guó)淀粉質(zhì)原料深加工工業(yè)的發(fā)展，工藝條件的不斷改變，一些淀粉原料深加工工藝需要在較低的pH值條件下進(jìn)行。所以，開(kāi)發(fā)新型耐酸性a-淀粉酶迫在眉睫。自1963年日本學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)耐酸性a-淀粉酶以來(lái)，能產(chǎn)生耐酸性a-淀粉酶的微生物大多為芽抱桿菌和曲霉。從酒曲中選育得到的嗜酸性的黑曲霉產(chǎn)酶菌株Tx-78,通過(guò)液體發(fā)酵，酒精沉淀以及二次離子交換層析得到最適pH為4.0,最適反應(yīng)溫度為70C,具有良好的耐酸性和熱穩(wěn)定性的耐酸性”-淀粉酶制劑13。蔡恒等14把a(bǔ)-淀粉酶的基因改造后，克隆到穿梭質(zhì)粒pBE2中，構(gòu)建了含突變笫淀粉酶基因的分泌

9、型誘導(dǎo)表達(dá)載體pBSAT,含有pBSAT的菌株可將突變笫淀粉酶分泌到胞外，分泌的a-淀粉酶具有較高的耐酸性。2淀粉酶的應(yīng)用在食品工業(yè)中的應(yīng)用各種酶制劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用已有上百年的歷史，最近幾十年a-淀粉酶廣泛地應(yīng)用于焙烤工業(yè)中笫淀粉酶用于面包加工中可以使面包體積增大，紋理疏松；提高面團(tuán)的發(fā)酵速度；改善面包心的組織結(jié)構(gòu)，增加內(nèi)部組織的柔軟度；產(chǎn)生良好而穩(wěn)定的面包外表色澤；提高入爐的急脹性；抗老化，改善面包心的彈性和口感；延長(zhǎng)面包心儲(chǔ)存過(guò)程中的保鮮期。目前，焙烤工業(yè)使用的生淀粉酶主要來(lái)自大麥麥芽、真菌和細(xì)菌。1955年，美國(guó)批準(zhǔn)真菌生淀粉酶作為面包添加劑。1963年，英國(guó)證實(shí)了它們的安全性15。

10、現(xiàn)在，口-淀粉酶已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)使用。在造紙工業(yè)中的應(yīng)用淀粉酶在造紙工業(yè)中的用途主要是改良紙張涂層淀粉， 由于造紙施膠過(guò)程中要保持淀粉乳的粘度， 壓扎機(jī)也要根據(jù)所造紙的級(jí)別來(lái)調(diào)整施膠的粘度，而且天然淀粉的粘度較高需經(jīng)處理降低其粘度后才能用于表明施膠，因此需要用生淀粉酶間歇式或連續(xù)降解淀粉來(lái)調(diào)整淀粉乳的粘度。在清潔劑生產(chǎn)中的應(yīng)用酶是現(xiàn)代高效清潔劑的成分之一。 酶在清潔劑中最大的功能就是使清潔劑更溫和無(wú)害。 早期的自動(dòng)洗碗機(jī)的清潔劑非常粗糙，容易在進(jìn)食時(shí)對(duì)人體造成傷害，而且對(duì)陶瓷、木質(zhì)餐具也會(huì)造成損害。而將酶制劑用于清潔劑以后，可以在較低的清洗溫度下就到達(dá)很好的清洗效果。1975年，a-淀粉酶開(kāi)

11、始用于洗衣粉中?，F(xiàn)在，幾乎90%以上的液體清潔劑中都含有a-淀粉酶16。在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用從最早的J.Takamine博士第一個(gè)使用米曲霉進(jìn)行“-淀粉酶工業(yè)生產(chǎn)，這一淀粉酶被稱(chēng)之為塔卡淀粉酶作為一種助消化劑開(kāi)始，淀粉酶在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用主要是作為助消化劑17。黑曲霉”-淀粉酶因具有耐酸性，適用于制造助消化的藥物，開(kāi)發(fā)適合于胃酸性環(huán)境（pH2.0左右）的耐酸性笫淀粉酶，用于制備消化助劑，將會(huì)使醫(yī)療效果更為有效18。另外分析血鏈球菌群中的細(xì)菌與“-唾液淀粉酶的結(jié)合能力，可有效鑒定不同血鏈球菌群中各菌株。研究唾液a-淀粉酶與致齦血鏈球菌粘附的關(guān)系，3結(jié)論綜上所述，”-淀粉酶是使用最廣泛的酶之一。除食品

12、和淀粉行業(yè)對(duì)它們的需求不斷增加，同時(shí)它們也用在諸如紙張紙漿、清潔劑和醫(yī)藥等其他行業(yè)。由于應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)大，對(duì)特異性的淀粉酶的需求越來(lái)越多。許多研究者對(duì)其進(jìn)行了深入的研究，現(xiàn)研究重點(diǎn)放在了發(fā)展微生物”-淀粉酶的耐熱性和耐酸堿性上，這將擴(kuò)展其使用的范圍，提高使用效率。無(wú)論如何，隨著科技的發(fā)展、研究的深入，淀粉酶將會(huì)得到更加廣泛的應(yīng)用。參考文獻(xiàn)1孫曉菲，李?lèi)?ài)江.”-淀粉酶的應(yīng)用及研究J.畜牧獸醫(yī)科技信息，2008(6):13-14.2凌家儉，王寧，王林濤.高活性a-淀粉酶的分離與純化J.蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)2009,29(5):930-932.3李輝，郭建強(qiáng)，岳麗麗，等.重組超耐熱酸性a-淀粉酶的分

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