1、質(zhì)譜分析法鑒定多形漢遜酵母質(zhì)譜分析法鑒定多形漢遜酵母Pex14p的磷酸化位點(diǎn)的磷酸化位點(diǎn)Identification of phosphorylation sites in Hansenula polymorpha Pex14p by mass spectrometry Pex14p是過氧化物酶體膜蛋白，它既參與過氧化物酶體的增殖，也參與過氧化物酶體的選擇性降解。 作者之前發(fā)現(xiàn)，活體多形漢遜酵母中的Pex14p 是以磷酸化形狀存在的。 但是，詳細(xì)的磷酸化位點(diǎn)和生理作用尚未知道。 本文經(jīng)過質(zhì)譜分析確定了Pex14p的詳細(xì)磷酸化位點(diǎn)，并試圖分析其在過氧化氫酶體增殖和吞噬中的作用。 H6-Pex14

2、p的cDNA和pHIPX4 載體銜接，得到pHIPX4-H6PEX14，轉(zhuǎn)化pex14細(xì)胞。 用含甲醇的培育基誘導(dǎo)酵母表達(dá)，培育基中僅含有32P的磷酸鹽。酵母中過氧化物酶體大量增殖。 隨著時間增長， Pex14p中的磷酸化位點(diǎn)都會變成32P標(biāo)志的。 質(zhì)譜分析 A 從過表達(dá)酵母菌株中提取H6-Pex14p ，然后進(jìn)展SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色 B 劃線部分是觀測的多肽序列，帶*的是磷酸化位點(diǎn) C 經(jīng)過分析質(zhì)譜圖得知，磷酸化位點(diǎn)在Thr248和Ser258 為了進(jìn)一步研討磷酸化的生理作用，作者選育三種不同的突變株，分別是T248A 、S258A 和T248A/S258A 突變體。 分別用Al

3、a取代T248和S258Pex14p的western blot結(jié)果中， 野生型WT呈現(xiàn)三條帶 推測T248A的Pex14p是因受激發(fā)而呈現(xiàn) 三條帶，詳細(xì)緣由尚不明確 S258A 和T248A/S258A 突變體分別呈現(xiàn) 兩條帶和一條帶野生型WT的酵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到甲醇平板后，產(chǎn)生大量過氧化氫酶體，磷酸化的Pex14p迅速誘導(dǎo)產(chǎn)生，非磷酸化化的Pex14p迅速減少，直至24h后檢測不到T248A 突變體的Pex14p動態(tài)與WT的很類似S258A突變體的Pex14p 動態(tài)與WT大體類似，只是直到24h還存在著非磷酸化帶T248A/S258A 雙突變體只呈現(xiàn)一條非磷酸化的Pex14p 條帶 之后轉(zhuǎn)移到

4、葡萄糖培育基中，此時過氧化物酶體被選擇性吞噬。 在吞噬過程中，過氧化氫基質(zhì)蛋白也被降解，如AOX。轉(zhuǎn)移到葡萄糖培育后，WT細(xì)胞中磷酸化的Pex14p由于吞噬作用在最初的0.5小時內(nèi)迅速減少相比之下，非磷酸化的Pex14p呈現(xiàn)相對緩慢的降解速度Pex14p降解的過程中，一切的突變體表現(xiàn)出了一樣的動力學(xué)特征在野生型細(xì)胞中，通常是經(jīng)過醇氧化酶AOX)的降解來判別過氧化物酶體吞噬作用的各種細(xì)胞中AOX的降解情況都非常類似。并且降解產(chǎn)生的低分子量的產(chǎn)物也已被檢測到去核后上清PNS30000g離心得到 細(xì)胞器膜球團(tuán)P和上清 S AOX醇氧化酶，過氧化氫酶體基質(zhì)蛋白AMO胺氧化酶，過氧化氫酶體基質(zhì)蛋白去核后上清PNS30000g離心得到 細(xì)胞器膜球團(tuán)P和上清 S AOX醇氧化酶，過氧化氫酶體基質(zhì)蛋白AMO胺氧化酶，過氧化氫酶體基質(zhì)蛋白在過氧化氫酶體誘導(dǎo)的條件下，Pex14p 在Thr248和Ser258的磷酸化作用，不影響基質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入過氧化氫酶體。 在過氧化物酶體增殖和選擇性降解過程中，與野生型相比，突變體并沒有明顯的表型差別。 Pex14p的磷酸化位