1、第十五章第十五章: : 甾體激素類藥物甾體激素類藥物的分析的分析基基 本本 要要 求求1掌握本類藥物的化學(xué)構(gòu)造、特征官能團(tuán)與掌握本類藥物的化學(xué)構(gòu)造、特征官能團(tuán)與分析方法的關(guān)系。分析方法的關(guān)系。2掌握高效液相色譜法、紫外分光光度法、掌握高效液相色譜法、紫外分光光度法、四氮唑比色法、異煙肼比色法、四氮唑比色法、異煙肼比色法、Kober反響比反響比色法等含量測定方法。色法等含量測定方法。3熟習(xí)本類藥物常用的鑒別實(shí)驗(yàn)和特殊雜質(zhì)熟習(xí)本類藥物常用的鑒別實(shí)驗(yàn)和特殊雜質(zhì)的檢查方法。的檢查方法。甾體激素類藥物的分析甾體激素類藥物的分析甾體激素類藥物甾體激素類藥物環(huán)戊烷并多氫菲母環(huán)戊烷并多氫菲母核的激素類藥物核的

2、激素類藥物Steriod Hormones甾體激素類藥物的分析甾體激素類藥物的分析1.甾體激素是在研討哺甾體激素是在研討哺乳動物內(nèi)分泌系統(tǒng)時發(fā)乳動物內(nèi)分泌系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性物質(zhì)現(xiàn)的內(nèi)源性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)史史2.1932年至年至1939年間，從腺體年間，從腺體中獲得雌酮中獲得雌酮(1932)、雌二醇、雌二醇(1932)、睪酮、睪酮(1935年年)及皮質(zhì)及皮質(zhì)酮酮(1939)等的純品結(jié)晶。等的純品結(jié)晶。 3.隨后，發(fā)明用薯蕷皂甙隨后，發(fā)明用薯蕷皂甙(Diosgenin)為原料進(jìn)展半合成為原料進(jìn)展半合成消費(fèi)甾體藥物，使消費(fèi)規(guī)模擴(kuò)消費(fèi)甾體藥物，使消費(fèi)規(guī)模擴(kuò)展，本錢降低展，本錢降低 4.發(fā)現(xiàn)腎上腺皮質(zhì)激素治

3、療風(fēng)發(fā)現(xiàn)腎上腺皮質(zhì)激素治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其在免疫調(diào)理上濕性關(guān)節(jié)炎及其在免疫調(diào)理上的重要價值，使甾體藥物成為的重要價值，使甾體藥物成為醫(yī)院中不可短少的藥物醫(yī)院中不可短少的藥物 5.甾體口服避孕藥的研討勝利，甾體口服避孕藥的研討勝利，使人類生育控制到達(dá)了新程度使人類生育控制到達(dá)了新程度 12341234567891011121314151617ABCD母體母體構(gòu)造構(gòu)造18181918192120母體衍母體衍生構(gòu)造生構(gòu)造甾體激素甾體激素腎上腺皮質(zhì)激素腎上腺皮質(zhì)激素性激素性激素雄性激素及蛋雄性激素及蛋白同化激素白同化激素孕激素孕激素雌激素雌激素分類分類藥理作用藥理作用一、腎上腺皮質(zhì)激素OHOOHOCH

4、2OHHHH311172021氫化可的松(hydrocortisone)OHOOHOHFHOCH3OHCH3醋酸地塞米松(dexamethasone acetate)16-甲基21-酯化17-羥基9-氟3-酮1,2-雙鍵11-羥基20-酮OCH3OHCH3HHOPFHHCH3OHOOONaONaOCH3CH3HOHHHODesoxycortisone Acetate)CH3OOCH3OHHCH3HFHHOOOH3CCH3CH3OO本類藥物構(gòu)造特征本類藥物構(gòu)造特征A環(huán)環(huán)4-3-酮基酮基,為為共軛體系共軛體系,在波長在波長240nm附近有紫附近有紫外吸收外吸收,部分藥物部分藥物在在C1-C2之間有

5、雙之間有雙鍵鍵,也有紫外吸收也有紫外吸收OCH3OHHCH3HFHHOOOH3CCH3CH3OO本類藥物構(gòu)造特征本類藥物構(gòu)造特征C17位上為位上為-醇酮醇酮基基,具有復(fù)原性具有復(fù)原性.多數(shù)多數(shù)藥物有藥物有C17-羥基羥基,部分藥物部分藥物-醇羥基醇羥基與酸成酯與酸成酯.OCH3OHHCH3HFHHOOOH3CCH3CH3OO本類藥物構(gòu)造特征本類藥物構(gòu)造特征部分藥物的部分藥物的C6或或C9位由鹵素取代位由鹵素取代,呈相呈相應(yīng)的鹵化物反響應(yīng)的鹵化物反響OCH3OHHCH3HFHHOOOH3CCH3CH3OO本類藥物構(gòu)造特征本類藥物構(gòu)造特征部分藥物部分藥物C11位上有位上有羥基或酮基取代羥基或酮基取

6、代二、雄性激素及蛋白同化激素CH3HHCH3HOHCH3O甲睪酮(methyltestosterone)OOHHHHOCH3丙酸睪酮(testosterone propionate)OOHHHHO苯丙酸諾龍(nandrolone phenylpropionate)17-17-羥基羥基作用更強(qiáng)作用更強(qiáng)吸收減緩吸收減緩CH3HHCH3HOHCH3O甲睪酮(methyltestosterone)A環(huán)環(huán)4-3-酮基酮基C17位上為羥基位上為羥基,部部分藥物的羥基被酯化分藥物的羥基被酯化雄性激素上的母核為雄性激素上的母核為19個個碳原子碳原子,蛋白同化激素在蛋白同化激素在C10位上普通無角甲基位上普通無

7、角甲基,母母核只需核只需18個碳原子個碳原子二、雄性激素及蛋白同化激素本類藥物構(gòu)造特征本類藥物構(gòu)造特征三、孕激素三、孕激素COHHHCH3O黃體酮(progesterone)CH3OCH3OCH3OHHHO醋酸甲地孕酮(megestrol acetate )乙酰氧基，乙酰氧基，具口服活性具口服活性C17C17位位-羥孕酮類羥孕酮類OHCH3HOHHH炔諾酮(norethisterone)H3C左炔諾孕酮左炔諾孕酮三、孕激素三、孕激素C19C19位去甲睪丸酮類位去甲睪丸酮類三、孕激素COHHHCH3O黃體酮(progesterone)A環(huán)環(huán)4-3-酮基酮基C17位上有甲酮基位上有甲酮基或乙炔基或

8、乙炔基.多數(shù)在多數(shù)在C17位上有位上有羥基羥基,部分藥物的部分藥物的羥基被酯化羥基被酯化四、雌性激素HOHHHOHCH3HstradiolHOHHCH3HthyinylestradiolCOHCH四、雌性激素HOHHHOHCH3Hstradiol有些藥物在有些藥物在C17位位上有乙炔基上有乙炔基,構(gòu)成構(gòu)成19-去甲孕甾烷母核去甲孕甾烷母核A環(huán)為苯環(huán)環(huán)為苯環(huán),C3位位上有酚羥基上有酚羥基,有的有的藥物藥物C3位上的酚位上的酚羥基成酯羥基成酯C17位上有羥基有位上有羥基有些藥物些藥物C17位羥基位羥基成酯成酯.種類主要活性基團(tuán)4-3-酮C17-醇酮基4-3-酮C17-羥基4-3-酮C17-甲酮基C

9、17-乙炔基A環(huán)為3-OH苯環(huán) UV、與重氮苯磺酸鹽反應(yīng)C17-乙炔基C17-羥基與硝酸銀反應(yīng)可成酯可成酯UV、與羰基試劑反應(yīng)與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)與硝酸銀反應(yīng)UV、與羰基試劑反應(yīng)性質(zhì)還原性UV、與羰基試劑反應(yīng)腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素及蛋白同化激素孕激素雌激素總結(jié)如下總結(jié)如下u 物理常數(shù)的測定物理常數(shù)的測定u 化學(xué)鑒別法化學(xué)鑒別法u 制備衍生物測定熔點(diǎn)制備衍生物測定熔點(diǎn)u UV UVu IR IRu TLC TLCu HPLC HPLC理化性質(zhì)與鑒別實(shí)驗(yàn)理化性質(zhì)與鑒別實(shí)驗(yàn)一、物理常數(shù)的測定1.1.熔點(diǎn)熔點(diǎn)HO+COClKOHCOO+KCl+H2O炔雌醇炔雌醇m.p.201OCCH3O+2HONH2

10、NCHOCH3NOH+2H2O黃體酮黃體酮雙肟m.p.238苯丙酸諾龍苯丙酸諾龍縮氨基脲縮氨基脲m.p.178185m.p.178185分解分解OCOCH2CH2OC6H5+NH2CNHNH2OHClNCH2NOH+H2O+HAcOCOCH2CH2N+H2OOHO+CH3CH2COOHOCOCH2CH3OKOH丙酸睪丸素丙酸睪丸素m.p.150156二、化學(xué)鑒別法2.比旋度比旋度3.吸收系數(shù)吸收系數(shù)與強(qiáng)酸的呈色反響與強(qiáng)酸的呈色反響官能團(tuán)的反響官能團(tuán)的反響1.與強(qiáng)酸的呈色反響甾體激素類藥物硫酸、磷酸、高氯酸、鹽酸硫酸、磷酸、高氯酸、鹽酸呈色與硫酸顯色反響與硫酸顯色反響 顯顯 色色 熒光熒光 加水

11、稀釋加水稀釋潑尼松龍潑尼松龍 深紅深紅 絮狀絮狀灰灰潑尼松潑尼松 橙橙 黃黃藍(lán)綠藍(lán)綠炔雌醚炔雌醚 橙紅橙紅 黃綠黃綠 紅色紅色 炔雌醇炔雌醇 橙紅橙紅 黃綠黃綠 絮狀絮狀玫紅玫紅醋酸可的松醋酸可的松 黃或微黃或微 褪色并澄褪色并澄 帶橙帶橙 清清2.官能團(tuán)的反響 C17- C17-醇酮基醇酮基復(fù)原性復(fù)原性A. 呈色反響呈色反響C17-醇酮基四氮唑鹽OH-呈色B. 沉淀反響沉淀反響C17-醇酮基氨制硝酸銀銀鏡反響C17-醇酮基堿性酒石酸銅Cu2OOHOOHOCH2OHHHH C3 C3酮基和酮基和C20C20酮基酮基甾酮類甾酮類2,4-2,4-二硝基苯肼二硝基苯肼呈色呈色異煙肼、硫酸苯肼異煙肼、

12、硫酸苯肼OOHNCONHNH2HClCONHNOHN異煙腙黃色異煙腙黃色睪酮睪酮C ON H NCC H3N H N OCNN異煙雙腙黃色異煙雙腙黃色OCCH3O2NCONHNH2HCl黃體酮黃體酮 甲酮基或活潑亞甲基甲酮基或活潑亞甲基亞硝基鐵氰化鈉間二硝基酚/芳香醛呈色COCH3O NOCNFe OHH2O2+-4Fe5CNNOCHCOO藍(lán)紫色藍(lán)紫色黃體酮黃體酮專屬鑒別反響專屬鑒別反響黃體酮黃體酮藍(lán)紫色藍(lán)紫色亞硝基鐵亞硝基鐵 氰化鈉氰化鈉其他甾體其他甾體淡橙色或淡橙色或不顯色不顯色有機(jī)氟有機(jī)氟F有機(jī)破壞有機(jī)破壞有機(jī)氯有機(jī)氯Cl有機(jī)鹵素有機(jī)鹵素茜素氟藍(lán)茜素氟藍(lán) 硝酸亞鈰硝酸亞鈰硝酸硝酸硝酸銀硝

13、酸銀AgCl 呈藍(lán)紫色呈藍(lán)紫色 乙炔基乙炔基RCCHAgNO3RCCAgOHCCHHO炔雌醇炔雌醇3AgNOOHCCAgHO白白 酯基酯基 酚羥基酚羥基雌激素類重氮苯磺酸紅色偶氮染料-3-3-酮、苯環(huán)、其他共軛構(gòu)造酮、苯環(huán)、其他共軛構(gòu)造構(gòu)造根據(jù)構(gòu)造根據(jù)240nm240nm左右左右280nm左右左右三、UV構(gòu)造特征：酚羥基、構(gòu)造特征：酚羥基、C17 C17 OHOH C17 C17 乙炔基乙炔基炔雌醇炔雌醇OHCCHHO四、IR1505cm-1OH 3505cm-13300cm-1CH CC 1590cm-13610cm-1OH 酚羥基酚羥基醇羥基醇羥基1615cm-1苯環(huán)的骨苯環(huán)的骨架振動架振

14、動黃體酮黃體酮COHHHCH3O構(gòu)造特征：構(gòu)造特征：-3-3-酮、酮、C17-C17-酮基酮基四、IR1700cm-1 C=O20位酮基位酮基1665cm-13位酮基位酮基1615cm-1870cm-1 C-H雙鍵雙鍵五、五、TLCTLC法法 主要用于甾體激素類藥物制劑的主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別鑒別 方法：對照品法方法：對照品法 要求供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏要求供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏色和位置與對照品溶液的主斑點(diǎn)一樣。色和位置與對照品溶液的主斑點(diǎn)一樣。 主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別如：醋酸曲安奈德軟膏、醋酸氟輕別如：醋酸曲安奈德軟膏、醋酸氟輕松軟膏松軟

15、膏 方法：對照品法方法：對照品法 要求在含量測定項下記錄的色譜要求在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品峰的圖中，供試品峰的tR與對照品峰的與對照品峰的tR一致。一致。六、六、HPLCHPLC法法一、有關(guān)物質(zhì)的檢查檢查方法具有一定分別才干 TLC法高低濃度對比法 HPLC法類似高低濃度對比法氫化可的松中其他甾體檢查氫化可的松中其他甾體檢查對照品對照品60g/ml供試品供試品3.0mg/mlvCHCl3-MeOH(9:1) 溶劑溶劑v硅膠硅膠GF254v二氯甲烷二氯甲烷-乙醚乙醚-甲醇甲醇-水水v 385 :60 : 15 : 2v展開后晾干展開后晾干v105枯燥枯燥10minv堿性四氮唑藍(lán)顯色堿

16、性四氮唑藍(lán)顯色一TLC斷定方法： 規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目 規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)顏色對照溶液0.02mg/ml供試液1 mg/ml二HPLC黃體酮中有關(guān)物質(zhì)檢查供試品溶液的雜質(zhì)峰數(shù)不得超越1個，其面積不得大于對照液的主峰面積的3/4二、硒的檢查來源 合成中用二氧化硒(SeO2)脫氫46SeSe鹽酸羥胺氧瓶燃燒有機(jī)藥物苯苯并并苯苯硒硒二二唑唑二二氨氨基基萘萘5 , 43,24 Se .pHnmA 環(huán)環(huán)己己烷烷三、溶劑殘留甲醇和丙酮(GC)0.3%0.5%四、游離磷酸鹽檢查四、游離磷酸鹽檢查 OnHMoOPHPOHPOMoOH24103433424還原還原鉬藍(lán)鉬藍(lán)鉬酸銨鉬酸銨磷鉬酸磷鉬酸740nm，UV-Visu

17、 HPLCu UVu 比色法u 非水溶液滴定法四氮唑比色法異煙肼比色法柯柏反響比色法一、HPLC對照液供試液己烯雌酚黃體酮二、UV-Vis化合物結(jié)構(gòu)max(nm)腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素孕激素雌激素2804-3-酮240醋酸地塞米松苯環(huán)苯環(huán)三、比色法 腎上腺皮質(zhì)激素類腎上腺皮質(zhì)激素類有有色色甲甲瓚瓚四四氮氮唑唑鹽鹽醇醇酮酮基基 17COH -復(fù)原復(fù)原CC6H5NNNNC6H5C6H5+Cl2e(H)CC6H5NNNNC6H5C6H5H2,3,5-Triphenyltatrazolium chloride TTC(Red tatrazoline RT)氯化三苯四氮唑三苯甲(Formazan)深紅色

18、 max 480490nm一四氮唑比色法一四氮唑比色法N+ClOCH3N+ClOCH3NCNC6H5NC6H5NCNC6H5NC6H5NCNC6H5NHC6H5NCNC6H5NC6H5OCH3NN+ClOCH3NCNC6H5NHC6H5NCNC6H5C6H5OCH3NNOCH3NH2e(H)2e(H)藍(lán)四氮唑藍(lán)四氮唑Blue tetrazoline BTBT-單甲BT-雙甲藍(lán)色藍(lán)色 max 525nm max 525nm氫化可的松軟膏的含量測定氫化可的松軟膏的含量測定 精細(xì)量取對照品溶液及供試品溶液各精細(xì)量取對照品溶液及供試品溶液各1ml，分別置枯燥具塞試，分別置枯燥具塞試管中，各精細(xì)加無水乙

19、醇管中，各精細(xì)加無水乙醇9ml與氯化三苯四氮唑試液與氯化三苯四氮唑試液1ml，搖，搖勻，各再精細(xì)加氫氧化四甲基銨試液勻，各再精細(xì)加氫氧化四甲基銨試液1ml，搖勻，在，搖勻，在25的暗的暗處放置處放置40min45min，在，在485nm的波優(yōu)點(diǎn)分別測定吸收度，的波優(yōu)點(diǎn)分別測定吸收度，計算，即得計算，即得 影響要素基團(tuán)基團(tuán)溶劑與水分溶劑與水分堿堿空氣中氧與光線空氣中氧與光線溫度與時間溫度與時間1基團(tuán)對反響速度的影響C11= O C17OHC21OH C21-酯酯2 溶劑、水分的影響溶劑、水分的影響含水量含水量5%含水含水10%A10%含水含水30%幾無反響幾無反響 無水乙醇(無醛)一四氮唑比色法

20、一四氮唑比色法3 O2與光線的影響 反響及其產(chǎn)物對光敏感，避光，隔絕空氣4堿的種類及參與順序堿的種類及參與順序反呼應(yīng)在強(qiáng)堿性反呼應(yīng)在強(qiáng)堿性pH13.75條件下進(jìn)展條件下進(jìn)展以氫氧化四甲基銨的結(jié)果最正確以氫氧化四甲基銨的結(jié)果最正確堿堿試試液液四四氮氮唑唑鹽鹽皮皮質(zhì)質(zhì)激激素素溶溶液液5 溫度與時間溫度與時間t甲分解甲分解%一四氮唑比色法一四氮唑比色法室溫室溫2525反響反響404045 min45 min( (二二) )異煙肼法異煙肼法(Isonicotinic acid hydrazide)(Isonicotinic acid hydrazide)+ONCONHNH2NCONNHINH4-3-酮

21、Isonicotinic acid HydrazideAh160異煙肼甲醇溶解對照液供試液腎上腺皮質(zhì)激腎上腺皮質(zhì)激素、素、 雄性激素和蛋雄性激素和蛋白同白同化激素、孕激化激素、孕激素素討論討論1 1反響速度反響速度C3= O C17= O 、 C20= O ； C11= O 不反不反響響專屬性強(qiáng)2 2溶劑的選擇溶劑的選擇異煙肼鹽酸鹽異煙肼鹽酸鹽甲醇、乙醇甲醇、乙醇無水3 3水分、水分、O2O2與光線的影響與光線的影響含水量含水量腙水解腙水解A%具塞容器，不揮發(fā)溶劑、不吸收水分時具塞容器，不揮發(fā)溶劑、不吸收水分時 O2與光線與光線無影響無影響甲醇對試劑的穩(wěn)定性好、甲醇對試劑的穩(wěn)定性好、呈色強(qiáng)度較

22、無水乙醇中呈色強(qiáng)度較無水乙醇中高、但對植物油的溶解高、但對植物油的溶解度小度小(4)酸、異煙肼的量鹽酸鹽酸 : 異煙肼異煙肼 = 2 : 1酸度酸度 異煙肼異煙肼酸度酸度 A(5)溫度t ( (三三) Kober) Kober反響比色法反響比色法第一步呈黃色max465nm共熱雌激素H2SO4 乙醇H2O or 稀H2SO4稀釋再加熱第二步桃紅色max515nmOHCH3O SOHCH3CH3O SOHCH3CH3O第二步反響515465450 500 550 nmAKober 反響吸收光譜第一步反響采用本法測定炔雌醇片及復(fù)方炔諾酮片、復(fù)方炔諾孕酮采用本法測定炔雌醇片及復(fù)方炔諾酮片、復(fù)方炔諾孕酮滴丸、復(fù)方左炔諾孕酮片中的炔雌醇的含量滴丸、復(fù)方左炔諾孕酮片中的炔雌醇的含量參與鐵酚試劑參與鐵酚試劑(NH4)2Fe(SO4)2 + H2SO4 + H2O2 + 苯酚苯酚* 鐵鹽的作用 加快黃色產(chǎn)物的構(gòu)成、轉(zhuǎn)化 加強(qiáng)紅色產(chǎn)物的穩(wěn)定性* 酚的作用 加快紅色產(chǎn)物的構(gòu)成 消除反響產(chǎn)生的熒光Iron-phenol Reagent第五節(jié)第五節(jié) 生物樣本中甾體激素的分析生物樣本中甾體激素的分析GC-MS:尿樣尿樣SPE萃取萃取衍生化衍