1、雞傳染性支氣管炎病毒的研究進展雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB是雞的一種急性、高度接觸性傳染病,它主要侵害呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)。本病呈世界性分布,對養(yǎng)雞業(yè)的危害極大,它能使成雞的增重和飼料報酬降低,雞蛋的產量、質量和孵化率下降,并直接導致雛雞死亡、腎臟病變和輸卵管永久性退化;另外,IB還經常做為病因之一參與混合感染,例如誘發(fā)慢性呼吸道病(CRD的爆發(fā),近年來,該病的流行呈上升趨勢,尤其腎病變型IB已蔓延至全國各養(yǎng)雞地區(qū),造成了嚴重的經濟損失。本病最早由美國Schalk和Hawn報道,臨床以患雞咳嗽、噴嚏和氣管噦音的呼吸道癥狀為主,之后陸

2、續(xù)在世界各國發(fā)生,1936年Beach和Schalm確定病原為病毒(呼吸型IBV,后命名為雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV,歸入冠狀病毒科,是冠狀病毒的代表株。1972年鄺榮祿等首次在廣東證實我國也有該病發(fā)生。傳染性支氣管炎病毒血清型較多,常見的有Massachussetts、Connecticat、lowa97、Iowa609、Hotle、JMK、Clark333、SEl7、Florida、Arkanass99和Australian“T”。1962年Wintefield等首次報道了腎型IBV,可引起腎臟腫大、尿酸鹽沉積等癥狀。1986年E1

3、 Houadfi等在摩洛哥首次分離到以G株為代表的嗜腸型IBV,主要引起呼吸道、腎臟及腸道病變。Gough等首先報道了英國存在一種新的特殊IBV血清型793/B,而來自西班牙、德國、希臘和墨西哥可疑血清樣本中亦可發(fā)現(xiàn)抗此血清型IBV的特異性抗體,法國、荷蘭、意大利、泰國等均有此血清型IBV的存在。IBV基因組核酸RNA復制的不連續(xù)機制及RNA聚合酶的不完全校對機制,使得病毒RNA在復制過程中易發(fā)生基因點突變、插入、缺失或重組,造成大量IBV變異株的出現(xiàn),目前世界上已分離到的IB血清型已達30種之多,不同血清型毒株疫苗之間僅有部分或無交叉保護作用, IB的多血清型性為其免疫預防增加了難度。1 I

4、BV的基因組雞傳染性支氣管炎病毒是正鏈單股RNA病毒,直徑為90200nm,是所有RNA病毒中最大的,蔗糖浮密度值常在1.151.18g/ml范圍內,病毒有囊膜,表面有間距較寬、呈放射性排列的桿狀纖突,長約20nm,使病毒外觀近似皇冠,纖突不穩(wěn)定,易從病毒粒子上脫落,當離心力超過100000r/min,甚至有時在37孵育,都會導致某些纖突成分的丟失,IBV 是第一個測定了基因組全部序列的冠狀病毒,長2730kh,有感染性,5末端為“帽子”結構,3末端含有共價結合的poly(A尾,至少有10個明顯的開放閱讀框架(ORF,編碼分子量6.7440kDa蛋白,病毒RNA各基因的定位次序如下:5-F1-

5、F2-S-3a-3b-3c-M-5a-5b-N poly(A-3。Boursnell等完成了對IBV-Beaudene株全基因組的測序,共有27608個核苷酸組成,不同IBV毒株的基因組長度略有差異。lBV被分為6個區(qū)域,由小到大分別被命名為MrnaAF。IBV含三種最主要特異性蛋白:纖突蛋白(Spike Glycoprotein,SGP,即S蛋白、膜蛋白(Membrane Glycoprotein,MGP,即M蛋白、核衣殼蛋白(Nucleocapsid Protein,NP,即N蛋白,分別由mRNA E、C、A編碼,三種結構蛋白的摩爾比為1:6:15,第四種小膜蛋白(sM與病毒囊膜有關。病毒

6、的血清型、血凝抑制和大多數(shù)的中和抗體均由S1蛋白決定和誘導。2 IBV的主要結構蛋白及功能2.1纖突蛋白(S S蛋白由mRNA B編碼,位于病毒粒子最表層的囊膜上,是構成病毒纖突的主要成分,是由23個相同的單體非共價連接構成的聚合物。S蛋白包含兩種糖多肽S1和S2,具有非常重要的生物學功能:S蛋白與宿主細胞膜上二糖蛋白受體的結合,使IBV吸附在宿主細胞上,只有S蛋白被宿主細胞的蛋白酶切割為Sl和S2兩條糖多肽時,病毒囊膜才有融細胞膜的活性;可誘導血凝抑制抗體和中和抗體(VN;S1蛋白的氨基N端決定IBV毒株的組織親和性及其毒力;S1蛋白是決定IBV血清特異性抗原決定簇的主要蛋白;S2糖蛋白可誘

7、發(fā)較弱的中和抗體,有免疫優(yōu)勢,并在大多數(shù)IBV毒株保守,可作為IBV 疫苗。2.2膜蛋白(M M蛋白是一種跨膜蛋白,它是IBV粒子中含量最多的糖蛋白,M蛋白由mRNA D所編碼,M蛋白的N端位于病毒離子外部并被糖基化。M蛋白具有控制并介導病毒粒子從粗面內質網膜或高爾基體膜出芽,在病毒裝配時與核衣殼相互作用,并將核衣殼結合到囊膜上的作用。對M蛋白的研究還發(fā)現(xiàn),與核衣殼蛋白和纖突蛋白相比,其免疫原性最低。然而,也有報道認為M蛋白上存在著重要免疫原性的抗原決定簇,但其免疫生物學功能,尤其是該蛋白在病毒致病過程中的作用及其與病毒的組織嗜性的關系還需要進一步研究。2.3核衣殼蛋白(N蛋白核衣殼蛋白是唯一

8、位于病毒內部的結構蛋白,位于囊膜內與基因組RNA緊密結合形成的核衣殼上,分子量為46kDa,由409個AA組成,被磷酸化,占病毒蛋白總量的40%,氨基酸中約有17%為堿性核苷酸,在整個基因組的進化過程中相對最為保守。N蛋白在病毒復制、組裝中有重要作用。N蛋白與前導RNA序列相互作用有助于病毒mRNA 合成和病毒RNA結合形成螺旋狀核衣殼,使之容易裝入病毒殼內。隨著病毒蛋白結合到基因組RNA包裝信號序列,N蛋白可能以協(xié)同方式結合到RNA重復位點,指導整個基因組的包裝。N蛋白還是免疫識別相關靶位,在細胞免疫免疫和體液免疫中起重要作用。據(jù)Koch等的報道,針對IBV N蛋白的單抗具有病毒中和活性,表

9、明在IBV感染細胞表面可表達N蛋白或其片斷,N蛋白在對IBV免疫應答中起作用。Boots等研究編碼N蛋白重組脫氧核糖核酸的免疫性發(fā)現(xiàn):用表達的融合蛋白首先免疫小鼠和雞。均能引起對IBV完整病毒粒子的免疫應答, Sang等對IBV核蛋白的結構和功能進行深入研究后的結果表明,在N蛋白C-末端前120個氨基酸為CTL抗原表位,可誘導細胞毒性T細胞反應,并對急性感染的雛雞具有保護作用,可見,IBV核蛋白具有重要的細胞免疫功能。2.4其它蛋白近年來,mRNA B、D、F被確認為是具有編碼功能的多順反子,Smith等將mRNA D的第3個ORF在細菌中表達,得到了1個12.4 kDa蛋白,與mRNA D第

10、3個ORf編碼蛋白的分子量相同,制取12.4kDa蛋白的抗血清,可從被IBV感染的Vero細胞中沉淀出1個12.4kDa,說明病毒粒子當中確實存在mRNA D,第3個ORF的產物。Liu等體外表達同一條mRNA D可翻譯出3個蛋白質(6.7kDa、7.4kDa、12.4kDa,這3條蛋白可在IBV粒子中檢測到,其中12.4kDa蛋白可能與病毒囊膜連在一起,可能與病毒復制有關,Liu等用同樣方法證明mRNA B可在體外翻譯出2個蛋白質(7.5kDa、9.5kDa,這些蛋白質同樣可在IBV感染細胞上檢測到,其中7.5kDa的蛋白由65個氨基酸組成,亮氨酸占26%(17個,有明顯的疏水性,這表明它可

11、能與病毒囊膜相連,9.5kDa蛋白功能尚不清楚。后經同樣的方式,RNA F 也被證實為具有編碼功能的多順反子。3 IBV的復制IBV的復制嚴格在受感染細胞的胞漿內完成。首先,在pH近中性條件下,IBV通過囊膜上的S糖蛋白與靶細胞膜上的特異受體相接觸而吸附在細胞表面,然后細胞膜與病毒囊膜融合使IBV核酸RNA進入宿主細胞漿,隨后病毒基因組RNA與核糖體結合,以便從5端翻譯出IBV特異的依賴于RNA的早期RNA聚合酶,在IBV基因組中,最靠近5端的兩個大ORF 可能與此有關。該RNA聚合酶使病毒的正鏈基因組RNA轉錄出一條全長的互補負鏈RNA,其5端有poly(U序列。以負鏈RNA為模板通過兩個不

12、同的晚期RNA聚合酶又進一步轉錄出新的正鏈基因組RNA(mRNA F和一套5個亞基因組mRNA(mRNAEA,它們5端和3端分別有“帽子”和“poly(A”結構,長度逐漸減小。mRNA E、C、A在5端特殊區(qū)(即比其小的mRNA中不存在的序列中各自含有單一的ORF,因此是功能性單順反子mRNA,分別編碼S蛋白、M蛋白和N蛋白。而mRNA F、D、B的5端特殊區(qū)均含有一個以上的ORF,這說明它們是功能性多順反子,mRNA F為新的正鏈基因組RNA(mRNA,它與原基因組RNA等長,是以負鏈RNA為模板拷貝下來的,其合成從負鏈RNA 3端開始,但啟動子或先導RNA的延長卻是從負鏈RNA上內部特異性

13、位點開始的,涉及naRNA F合成的依賴RNA的RNA聚合酶與合成負鏈RNA的RNA聚合酶不同,主要表現(xiàn)在前者需要先導RNA作為引物。mRNA含三個ORF(3a、3b、3c,它們分別編碼6.7kDa、7.4kDa和12.4kDa多肽,其中3a的保守性(包括位置、長度、序列最好,而3b和3c的序列變異程度較大。由于IBV各毒株內均存在這三個ORF,所以mRNA 3可能編碼一些以前未曾確定的病毒多肽,是一種功能性三順反子,在病毒復制中發(fā)揮作用。與mRNA 3相似,mRNA 5也是一種功能性多順反子,含兩個ORF(5a和5b,分別編碼7.4kDa和9.5kDa多肽,5a和5b編碼的多肽有何作用尚不清

14、楚。根據(jù)Kozak的滲漏掃描(Leaky Scanning機制,在翻譯起始鄰近序列5-GCCA/GCCAUGG中,-3和+4位的瞟呤堿基對核糖體識別AUG這一翻譯起始信號的效率很重要(一般-3和+4位分別為A和G,若AUG鄰近序列不是最佳,則部分核糖體可能在該處不起動,而向下游搜尋處于最佳序列的AUG,但IBV mRNA的翻譯機制與上述規(guī)則略有不同。例如,Binns等曾報道,mRNA中5a的起始序列(-3和+4位分別為A和G雖然比5b(-3和+4位分別為G和A優(yōu)越,但試驗結果卻表現(xiàn)5b的表達較5a容易。大多數(shù)真核生物的mRNA僅編碼單一蛋白,為單順反子mRNA,而近年來不斷發(fā)現(xiàn)許多動物病毒可編

15、碼雙或多順反子mRNA,例如IBV的mRNA 3和mRNA 5等,它們的翻譯方式與單順反子不太一樣,對其產生機制及表達產物的功能正在研究中。IBV的結構及非結構蛋白可能通過兩個階段,分別按不同機制翻譯和調節(jié),在結構蛋白中,N蛋白產生于細胞質的多核糖體上,經磷酸化后與新合成的基因組RNA相互形成螺旋狀的核衣殼,M糖蛋白的合成發(fā)生與RER膜結合的多糖體上,其產物在開始后5min,才能依賴信號識別子對某個內部信號序列的識別而被插入RER膜,糖基化的過程則要等多肽轉運到高爾基體后才能進行。S糖蛋白雖然也在RER膜結合的多核糖體上合成,但它與M蛋白明顯不同,表現(xiàn)為:由于氨基酸帶有信號序列,所以多肽合成后

16、,馬上就邊翻譯邊插入RER膜;N-糖基化過程與翻譯同時進行。S蛋白在RER膜上裝配成多聚體纖突后,在高爾基體中參與毒粒合成。過剩的S蛋白則被轉運并插入到宿主細胞膜。S蛋白在翻譯后將被宿主細胞的蛋白酶切為S1和S2兩個糖多肽,這個過程發(fā)生在哪個細胞器還不是很清楚,但最近有證據(jù)表明,高爾基體或細胞膜是最有可能的部位。一般來說,不經過切割的S蛋白缺乏激活病毒溶細胞活性的能力。由于M蛋白只在高爾基體積累,所以IBV新合成的毒粒也僅從那里出芽。在出芽部位,宿主細胞蛋白不斷被病毒糖蛋白排斥而取代,同時,螺旋狀核衣殼鏈按順序排列到膜上含病毒糖蛋白的地方。S蛋白對毒粒裝配不起主要作用,因為通過衣霉素(tuni

17、camycin阻斷其合成后,仍有含正常量的核衣殼蛋白和M蛋白的毒粒產生。完整毒粒在高爾基體經過修飾后,被包入滑囊囊泡(Smoothwalled中,釋放到細胞漿內,一些有囊膜的病毒可能通過這樣的方法躲避宿主免疫系統(tǒng)的防疫機制,長期存在于宿主體內(因為囊膜與免疫系統(tǒng)是隔絕的。毒粒的釋放有兩種方式,一是從裂解的感染細胞中直接釋放;二是含毒粒的囊泡被轉運到細胞邊緣,在這里通過細胞分泌器或溶細胞膜作用從完整的細胞中釋放出來,由于不會造成宿主細胞裂解,所以這種釋放方式為IBV創(chuàng)造了溫和感染宿主的條件。已釋放的毒粒往往聚集在感染細胞的表面,似細胞膜出芽狀,其機制有待于進一步探討,初步估計它與刺激宿主產生免疫

18、反應有關。4 IBV的變異機制IBV基因容易發(fā)生變異的原因主要有以下幾點:首先,RNA易降解,不穩(wěn)定;其次,缺乏作為單鏈RNA的互補鏈,不穩(wěn)定,IBV的RNA聚合酶缺乏校對機制,使得每一輪復制過程中都有可能誘發(fā)變異;再次,IBV是按照特殊的先導引物轉錄機制進行RNA合成的。RNA聚合酶必須沿模板“跳躍”前進,并且合成的是一組不連續(xù)的但某些區(qū)域又很相似的mRNA。這就造成RNA聚合酶有可能不完全沿著一條模板移動,其結果必然導致高頻突變或重組的發(fā)生。一般來說,IBV的毒力和抗原性是由病毒蛋白的性質決定的,因此它們之間的差異實際上是由基因變異造成的。近年來,分子生物學技術的發(fā)展為從基因水平上探討IB

19、V的變異機制提供了條件。大量的基因序列分析結果表明,IBV的S1、S2、M和N基因均可發(fā)生變異,但S1基因變異最為活躍,是抗原變異的主要部位。由于S1蛋白上存在血清型特異性中和位點,且與病毒的抗原性和毒力密切相關,因此,S1基因變異的研究對闡明病毒的變異機制具有十分重要的意義。Sapats比較了澳大利亞從上世紀6-90年代近30年在抗原性和致病性不同的9株分離株的S1基因,將其中9株分離株分為兩組,結果表明VieS、N2/75、V5/90、Nl/62、N3/62和N9/74(組ISl基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為82.8%和80.7%。氨基酸差異大多出現(xiàn)在53152、192202、288

20、-313位間;而N1/88、03/88和18/9l(組S1蛋白的差異平均分布于整個蛋白中。但有4個保守區(qū)域在2933、115120、245251和516520位間。組I與組間Sl蛋白的氨基酸的躍度發(fā)生變化,數(shù)量從54l(N2/75個至5.48(Q3/88個不等。氨基酸數(shù)量上的差異可能是插入和缺失的結果,大多數(shù)位于第59313殘基間。一般認為冠狀病毒的N蛋白是高度保守的,同一種病毒的不同毒株間的同源性達90%以上。有報道證實,IBV的N基因也有較大的變異性,盡管這些變異不會影響N基因和3端非翻澤區(qū)(UTR的核苷酸序列。Sapats等比較8株與經典毒株具有不同致病性、組織嗜性的澳大利亞分離株的IB

21、V的N基因和3端非翻譯區(qū)(UTR的核苷酸序列,發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)進化上這些毒株可分為兩組,結果表明,VieS、N1/62、N9/74、N2/75和V5/90株(組IN蛋白的氨基酸殘基序列有92.3%98.8%的同源性,N1/62、Q3/88和18/91個毒株間(組有85.5%89.2%的同源性,但與組I病毒的同源性只有60.0%63.3%。氨基酸的替換、缺失和插入分布于整個N蛋白,并涉及到以前被認為是保守的的區(qū)域。盡管兩組病毒間有相當大的差異,但所有病毒的N蛋白都含有高比例的殘基,其中有80%的殘基位置是保守的,另外,所有的毒株含有約30個絲氨酸殘基,其中有10個是保守的,大多數(shù)位于168194。N蛋白92103位間是高度保守的,因此,N蛋白內大量氨基酸殘基的改變并不影響其完整性或功能。這些分離株N基因系統(tǒng)進化關系與S1基因系統(tǒng)進化關系是平行進化的,因此以N基因和S1基因為