1、第十章第十章 核酸擴(kuò)增技術(shù)核酸擴(kuò)增技術(shù)生物樣品生物樣品但是，目的基因在樣品中含量很低但是，目的基因在樣品中含量很低如果我們能這樣就好了如果我們能這樣就好了 1971年，Khorana提出：經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆基因。 但由于測(cè)序和引物合成的困難，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了DNA變性、復(fù)性（退火） 退火退火不同來(lái)源的核酸經(jīng)不同來(lái)源的核酸經(jīng)變性變性和和復(fù)性復(fù)性的過(guò)程，其中一的過(guò)程，其中一些些局部堿基互補(bǔ)片段局部堿基互補(bǔ)片段在復(fù)性時(shí)在復(fù)性時(shí)形成雜化雙鏈形成雜化雙鏈的過(guò)程。的過(guò)程。加熱加熱核酸分子雜交DNA半保留復(fù)制體內(nèi)DNA的生物合成很

2、少有在公司工作的科研人員獲得很少有在公司工作的科研人員獲得諾貝爾，諾貝爾，Mullis是其中之一是其中之一美國(guó)美國(guó)CetusCetus公司的公司的（1944-1944-），原本是要），原本是要合成合成DNADNA引物來(lái)進(jìn)行測(cè)序工引物來(lái)進(jìn)行測(cè)序工作，卻常為沒(méi)有足夠的模板作，卻常為沒(méi)有足夠的模板DNADNA而煩惱。而煩惱。19831983年春夏之交的一個(gè)晚上，年春夏之交的一個(gè)晚上，他開(kāi)車(chē)去鄉(xiāng)下別墅的路上萌他開(kāi)車(chē)去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用發(fā)了用兩個(gè)兩個(gè)引物（引物（而不是一而不是一個(gè)引物個(gè)引物）去擴(kuò)增模板）去擴(kuò)增模板DNADNA的的想法想法Mullis的方法55退火退火94變性變性引物引物引物引物37加

3、入加入DNA聚合酶聚合酶引物引物引物引物第一輪循環(huán)第一輪循環(huán)第二輪循環(huán)第二輪循環(huán)第三輪循環(huán)第三輪循環(huán)945537大腸桿菌大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶由于大腸桿菌由于大腸桿菌DNADNA聚合酶不耐熱，每個(gè)循環(huán)都要加酶聚合酶不耐熱，每個(gè)循環(huán)都要加酶()40 50 60 70 80 90100 80 60 40 20錢(qián)嘉韻（ 1973 年）由于由于Taq DNATaq DNA聚合酶耐熱，一次加酶可進(jìn)行多個(gè)循環(huán)聚合酶耐熱，一次加酶可進(jìn)行多個(gè)循環(huán) 一種能在體外特異地?cái)U(kuò)增特定核酸片段一種能在體外特異地?cái)U(kuò)增特定核酸片段的技術(shù)，可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)將極微量的的技術(shù)，可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)將極微量的目的基因擴(kuò)增成千上

4、萬(wàn)倍。目的基因擴(kuò)增成千上萬(wàn)倍。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Polymerase Chain Reaction加熱使雙螺旋的模板DNA分開(kāi)，形成單鏈DNA 。降低溫度，引物和DNA模板的互補(bǔ)區(qū)域形成局部雜交。 在模板鏈的指導(dǎo)下，DNA聚合酶將4種脫氧核苷酸（dNTP）沿53方向加到引物上，形成新的DNA鏈。4、以上三個(gè)步驟的循環(huán)。變性變性延伸延伸退火退火949850657075PCRPCR三步曲三步曲n變性變性 94949898n退火退火 50506565n延伸延伸 707075751234522557294時(shí)間（min）溫度（）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高

5、溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA94PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)55引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理P

6、CR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)第1輪結(jié)束第2輪變性、退火延伸第3輪變性、退火延伸PCRPCR理論擴(kuò)增效率理論擴(kuò)增效率循環(huán) 初始模板擴(kuò)增倍數(shù) 目的DNA擴(kuò)增倍數(shù)120240362488510221020100420401048536306010737417642n-2nPCR的特點(diǎn)特異性強(qiáng)：PCR擴(kuò)增的特異性取決于引擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板物與模板DNA的特異性結(jié)合的特異性結(jié)合靈敏度高n 皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量級(jí)擴(kuò)增到微克量級(jí)擴(kuò)增到微克( (ugug=10=10-6-6) )水平水平n 能從能從100100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞n

7、病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3 3個(gè)個(gè)RFURFUn 細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3 3個(gè)細(xì)菌個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便快捷：一次性加好反應(yīng)液，一次性加好反應(yīng)液，2 24 4 小小時(shí)完成擴(kuò)增時(shí)完成擴(kuò)增1. 對(duì)樣本要求低：血液、體腔液、洗嗽液、血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等；毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等；DNA/RNADNA/RNA；純品；純品/ /粗品粗品DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）酶）引物引物原料（原料（dNTPdNTP）模板（模板（DNADNA分子分子) )BufferBuffer（Mg2+Mg2+）緩沖液緩沖液（酶促劑酶促劑）PCR體系組成體系組成:總體積

8、總體積20-100 l （不足用（不足用ddH2O)引物引物dNTP 模板模板DNABuffer（Mg2+）（Thermus aquaticus)價(jià)格適宜，延伸速度價(jià)格適宜，延伸速度1kb/min，無(wú)校正功能；具有類(lèi)似末端轉(zhuǎn)移酶的活性，末端加無(wú)校正功能；具有類(lèi)似末端轉(zhuǎn)移酶的活性，末端加A； 使用濃度：使用濃度：（酶量過(guò)多，反應(yīng)特異性下（酶量過(guò)多，反應(yīng)特異性下降；酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量）。降；酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量）。有很強(qiáng)的校正功能，延伸速度有很強(qiáng)的校正功能，延伸速度500bp/min，價(jià)格昂貴。，價(jià)格昂貴。普通普通rTaq和和Pfu DNA聚合酶的混合物聚合酶的混合物 （1 1）引物長(zhǎng)度：）引物

9、長(zhǎng)度：為宜。為宜。（2 2）引物組成：）引物組成：引物對(duì)堿基組成一致。引物對(duì)堿基組成一致。（3 3）引物結(jié)構(gòu)：）引物結(jié)構(gòu)：堿基盡可能隨機(jī)分布；內(nèi)部、兩引物間避堿基盡可能隨機(jī)分布；內(nèi)部、兩引物間避免有互補(bǔ)序列；引物免有互補(bǔ)序列；引物3 3端為關(guān)鍵，必需與模板堿基配對(duì)端為關(guān)鍵，必需與模板堿基配對(duì)（最好是（最好是G/CG/C）；）；5 5端無(wú)嚴(yán)格限制，可以修飾。端無(wú)嚴(yán)格限制，可以修飾。（4)4)引物特異性：引物特異性：與目的基因特異配對(duì)，與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源與目的基因特異配對(duì)，與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源性。性。引物濃度：引物濃度： ，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好；，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好； 濃度過(guò)高

10、易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配, ,反應(yīng)特異性下降。反應(yīng)特異性下降。l濃度：取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度濃度：取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度（濃度過(guò)高易產(chǎn)生堿基錯(cuò)配，濃度過(guò)（濃度過(guò)高易產(chǎn)生堿基錯(cuò)配，濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量；四種低則降低反應(yīng)產(chǎn)量；四種dNTP濃度應(yīng)相等，任何一種偏高濃度應(yīng)相等，任何一種偏高或偏低，也會(huì)引起錯(cuò)配）或偏低，也會(huì)引起錯(cuò)配） l dNTP溶液小量分裝，置溶液小量分裝，置-20冰凍保存，減少凍融次數(shù)冰凍保存，減少凍融次數(shù)純度要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、純度要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚聚合酶抑制劑、合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類(lèi)。結(jié)合蛋白類(lèi)。一般一般50

11、-100ng DNA模板模板/100 L。模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH 促進(jìn)引物退火促進(jìn)引物退火穩(wěn)定酶活性穩(wěn)定酶活性促進(jìn)引物與模板配對(duì)，促進(jìn)引物與模板配對(duì)， 特異產(chǎn)物增加，靈敏度增加特異產(chǎn)物增加，靈敏度增加 可影響酶活性、解鏈溫度、退火溫度、擴(kuò)增效率、可影響酶活性、解鏈溫度、退火溫度、擴(kuò)增效率、擴(kuò)增特異性和引物二聚體的形成等。擴(kuò)增特異性和引物二聚體的形成等。 Taq酶活性需要酶活性需要Mg2+ ，Mg2+濃度過(guò)高導(dǎo)致非特異濃度過(guò)高導(dǎo)致非特異擴(kuò)增。在一般的擴(kuò)增。在一般的PCR反應(yīng)中，各種反應(yīng)中，各種dNTP濃度為濃度為200 mol/L

12、時(shí)，時(shí)，Mg2+濃度為濃度為1.02.5mmol/L為宜。為宜。 注意：注意：PCR體系中的體系中的dNTP、引物和模板的磷酸基、引物和模板的磷酸基都可以和都可以和Mg2+結(jié)合，從而降低游離結(jié)合，從而降低游離Mg2+的濃度。的濃度。94-98；破壞破壞DNA中可能存在的較難破中可能存在的較難破壞的二級(jí)結(jié)構(gòu)壞的二級(jí)結(jié)構(gòu)94-98/3060s；50-65/3060s； 原則：比引物原則：比引物Tm低低35，或計(jì)算：，或計(jì)算： 退火溫度退火溫度()4(G+C)2(A+T)(510)70-75（72 ）/1min(1kb)；一般為一般為25-35次（次數(shù)過(guò)多，擴(kuò)增效率次（次數(shù)過(guò)多，擴(kuò)增效率降低，錯(cuò)誤率

13、增加）降低，錯(cuò)誤率增加）72，410min，確保充分延伸。，確保充分延伸。模模 板：板：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2 l底底 物：物：dNTP（each 0.5mM） 2 l引引 物：物：上、下游引物（5M） 各1 l復(fù)制酶：復(fù)制酶：Taq DNA聚合酶（5U/l ） 0.2 l緩沖液：緩沖液：10buffer（含Mg2+) 2 l滅菌ddH2O 11.8 l（20 l體系），混勻（1 1）預(yù)變性：）預(yù)變性：94 3min；（2 2）變性）變性- -退火退火- -延伸循環(huán)：延伸循環(huán)：94 40s，55 1min，72 1min，30個(gè)循環(huán)；個(gè)循環(huán)；（3 3）循環(huán)后延伸、保存：）循環(huán)后延伸、保存：72 5mi

14、n；4 保存。保存。 是否為特異性擴(kuò)增？是否為特異性擴(kuò)增？ 依據(jù)研究對(duì)象和目的不同而采用不依據(jù)研究對(duì)象和目的不同而采用不同的分析方法。同的分析方法。 凝膠電泳可以幫助判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及產(chǎn)量凝膠電泳可以幫助判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及產(chǎn)量2. 酶切分析酶切分析 既能進(jìn)行產(chǎn)物鑒定，又能進(jìn)行基因分型，還能進(jìn)行變既能進(jìn)行產(chǎn)物鑒定，又能進(jìn)行基因分型，還能進(jìn)行變異性研究異性研究3. 分子雜交分析分子雜交分析 分子雜交是檢測(cè)分子雜交是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測(cè)測(cè)PCR產(chǎn)物堿基突變的有效方法產(chǎn)物堿基突變的有效方法4. 測(cè)序分析測(cè)序分析 DNA測(cè)序是檢測(cè)測(cè)序是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特

15、異性的最可靠方法，不僅產(chǎn)物特異性的最可靠方法，不僅能進(jìn)行基因分型，還能進(jìn)行變異性研究能進(jìn)行基因分型，還能進(jìn)行變異性研究設(shè)立（無(wú)模板的）陰性、空白對(duì)照，可檢設(shè)立（無(wú)模板的）陰性、空白對(duì)照，可檢測(cè)反應(yīng)體系是否被污染。測(cè)反應(yīng)體系是否被污染。設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照（設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照（GAPDH、-actin），可），可檢測(cè)反應(yīng)體系是否被正常工作。檢測(cè)反應(yīng)體系是否被正常工作。 無(wú)目的無(wú)目的DNA產(chǎn)生：產(chǎn)生： 1）檢查引物內(nèi)或引物間是否存在配對(duì)；）檢查引物內(nèi)或引物間是否存在配對(duì)； 2）降低退火溫度，延長(zhǎng)退火時(shí)間及延伸時(shí)間；）降低退火溫度，延長(zhǎng)退火時(shí)間及延伸時(shí)間； 出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶 1）增加退火溫度，減少

16、退火時(shí)間及延伸時(shí)間；）增加退火溫度，減少退火時(shí)間及延伸時(shí)間； 2）降低引物及）降低引物及Taq 酶的量。酶的量。 研究基因克隆，DNA測(cè)序，分析突變 診斷 細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)檢測(cè)，診斷 人類(lèi)基因組工程遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測(cè)序，表達(dá)圖譜 法醫(yī)犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析 腫瘤各種腫瘤檢測(cè) 其他44用途用途:獲得所需獲得所需cDNAcDNA片段；片段；檢測(cè)檢測(cè)mRNAmRNA的剪接差異；的剪接差異；檢測(cè)基因表達(dá)水平。檢測(cè)基因表達(dá)水平。RT-PCRRT-PCR原理：原理：特異性引物，特異性引物，DNA聚合酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈雜化雙鏈PCRPCR擴(kuò)增目的擴(kuò)增目的cDNAcDNARNARNA酶，水解酶

17、，水解mRNAmRNAOligo dT, 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶特別注意防止RNA酶的污染。 盡量保證各試管相同試劑的用量一致（2個(gè)以上樣品）。取反轉(zhuǎn)錄酶等酶類(lèi)時(shí)，要輕輕混勻，避免起氣泡。分取之前要輕輕地離心收集到反應(yīng)管底部，因其粘度高，所以要慢慢地分取。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可選擇隨機(jī)引物（Random 9mers）、Oligo dT Primer和目的基因的下游引物三者之中的任一種。隨機(jī)引物適合于鏈比較長(zhǎng)或具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA，并適合所有種類(lèi)的RNA（rRNA、mRNA、tRNA）；Oligo dT Primer只適合于具有poly（A）尾的mRNA，且擴(kuò)增片段的位置不能離poly（A）尾太遠(yuǎn)，其反轉(zhuǎn)錄效率

18、很高目的基因的下游引物常常是在目的基因RNA的序列已知情況下使用，其特異性很強(qiáng)。對(duì)于那些豐度低的mRNA，可以同時(shí)采用不同的欲擴(kuò)增基因的下游引物共同反轉(zhuǎn)錄，這樣，同一反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以同時(shí)開(kāi)展若干PCR，而且由于引物相對(duì)單純，PCR成功的可能性大。反轉(zhuǎn)錄預(yù)處理：將RNA模板與引物在沒(méi)有反轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)混合物用6570處理5-10min 充分破壞RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使引物和RNA模板之間可以準(zhǔn)確配對(duì)。隨后，樣品要迅速置于冰水中冷卻，并在冰上將反轉(zhuǎn)錄酶加入反應(yīng)體系中反轉(zhuǎn)錄酶的工作溫度較低（一般為37或42）組織總RNA（2ug） 2lOligo(dT)18 primer 1lWater,nuclease-

19、free 9l混勻，輕微離心；65 5min，快速插入冰水中，冰上加入：5Reaction Buffer 4lRNase inhibitor 1ldNTP（each 10mM） 2lM-MuLv RT（逆轉(zhuǎn)錄酶） 1l混勻，輕微離心；42 60min，70 5min（滅活逆轉(zhuǎn)錄酶）。-20保存。反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄:鑒于傳統(tǒng)RT-PCR所固有的限制，在有條件的實(shí)驗(yàn)室，可以采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR。 利用利用熒光信號(hào)的變化熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板起始模板

20、進(jìn)行進(jìn)行定定量量分析分析CT值：C代表Cycle，t代表threshold。CT值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。其可信值一般是18-35。 CTCT值的確定值的確定（前（前1515個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)）個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)） 根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量PCR又又可以分為可以分為T(mén)aqMan探針和探針和SYBR Green I熒熒光染料兩種方法。光染料兩種方法。 探針雜交法：探針雜交法：在原理上更為嚴(yán)格，所得數(shù)在原理上更為嚴(yán)格，所得數(shù)據(jù)更為精確；據(jù)更為精確； 熒光染料法：熒光染料法：成本更為低廉，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更成本

21、更為低廉，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)便。為簡(jiǎn)便。 （1 1）熒光染料法）熒光染料法SYBR Green I染料染料 SYBR Green ISYBR Green I是一種只與是一種只與DNADNA雙鏈結(jié)合的熒光雙鏈結(jié)合的熒光染料。染料。當(dāng)它與當(dāng)它與DNADNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從DNADNA雙雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在一鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在一個(gè)體系內(nèi)，個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNADNA分子的數(shù)量分子的數(shù)量。 在在PCRPCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBRSYBR熒光染料，熒光染料，SYBRSYBR熒光染料特異性地?fù)饺霟晒馊玖咸禺愋缘負(fù)饺隓NADNA雙鏈后，發(fā)射熒光雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，