1、病毒轉(zhuǎn)染原理及步驟在細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作中，對(duì)于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無(wú)法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞， 通過(guò)病毒介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼蟠筇岣呋虻霓D(zhuǎn)導(dǎo)效率， 以達(dá)到目的基因的高效瞬時(shí) 表達(dá)。病毒轉(zhuǎn)染包括以下步驟：1構(gòu)建載體2包裝提純病毒3感染靶細(xì)胞。以慢病毒 為例。慢病毒(Lentivirus )載體是以HIV-1 (人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái) 的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具 有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將 外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可 有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)

2、胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多 種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果，在美國(guó)已經(jīng)開展了臨床研究， 效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。一、慢病毒載體構(gòu)建原理：慢病毒載體的包裝系統(tǒng)一般由兩部分組成，即包裝成分和載體成分。包裝成分 由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建， 能夠反 式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白；載體成分則與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、 逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列，同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)及 在此位點(diǎn)插入的目的基因。將包裝成分與載體成分的多個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞， 即可在細(xì)胞上清中收獲攜帶目的基因的復(fù)制缺陷型慢病毒載體顆粒。慢病毒表達(dá)載體包

3、含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝 質(zhì)粒可提供所有的轉(zhuǎn)錄并包裝 RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞， 在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心 取得上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后， 經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。L町析* riVMvsIk?對(duì)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，這就為RNAi，cDNA克隆以及報(bào)告基因的研

4、究提供了一個(gè)有利的途徑。對(duì)進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn) 細(xì)胞株的篩選，為活體動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液提供基 礎(chǔ)。、慢病毒載體構(gòu)建及包裝流程：（一）實(shí)驗(yàn)流程（1和2為并列步驟）1慢病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)上下游特異性擴(kuò)增引物，同時(shí)引入酶切位點(diǎn)，PCR（采用高保真KOD酶，3K內(nèi)突變率為0%）從模板中（CDNA質(zhì)?；蛘呶膸?kù)）調(diào)取目的基因CDS區(qū)（coding sequenc0連入T載體。將CDS區(qū)從T載體上切下，裝 入慢病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體。2. 慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建合成siRNA對(duì)應(yīng)的DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)，退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體3慢病毒載體的包裝與濃縮純化制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件

5、載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行 高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換為完全培養(yǎng)基， 培養(yǎng)24和48h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒上清液 通過(guò)超離心濃縮病毒。（二）實(shí)驗(yàn)材料：慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pspax2, pMD2G,pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中質(zhì)粒上的 ZsGreen1 表達(dá)框能 表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）。細(xì)胞株293T，慢病毒的包裝細(xì)胞，為貼壁依賴型成上皮樣細(xì)胞，生長(zhǎng)培 養(yǎng)基為DMEM（含10% FBS）。貼壁細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)生長(zhǎng)增殖形成單層細(xì)胞。菌株大腸桿菌菌株DHa。用于擴(kuò)增

6、慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。CMVtnv re-vpVCQRI WnipCMV "Mi汕、慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法（一）慢病毒轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法1、慢病毒轉(zhuǎn)染前18-24小時(shí)，將貼壁細(xì)胞以1 X105/孔鋪到24孔板中。使細(xì)胞在 慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)的數(shù)量為2X105/孔左右。2、第二天，用含有6卩g/ml polybren的 2ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入 適量病毒懸液。37 T孵育。3、（對(duì)polybrene毒性敏感的細(xì)胞選作此步驟）4小時(shí)后加入2ml新鮮培養(yǎng)基以 稀釋 polybrene。4、繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培5、 繼續(xù)培養(yǎng)。如果慢病毒含有熒光蛋白，一

7、般轉(zhuǎn)染48小時(shí)后可見(jiàn)明顯熒光表達(dá)，72小時(shí)后更加明顯。如需FACS檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，可在轉(zhuǎn)染后 72-96小 時(shí)進(jìn)行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加藥篩選，可以在轉(zhuǎn)染3-4天后開始加藥。（二）慢病毒轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法1、在2X105/ml懸浮細(xì)胞中加入polybrene至6卩g/m和適量病毒，充分混勻。37C孵育。或者150g室溫離心4小時(shí)（選作，部分難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系采用此步 驟可以提高轉(zhuǎn)染效率）。2、（對(duì)polybrene毒性敏感的細(xì)胞選作此步驟）4小時(shí)后（或離心結(jié)束后）加入等 體積新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybre ne。3、繼續(xù)培養(yǎng)3-4天。中間視細(xì)胞生長(zhǎng)情況可傳代或換液。病毒感染細(xì)胞本來(lái)效率

8、就較低，一定要注意以下幾點(diǎn)：1.感染時(shí)的培養(yǎng)基盡量少些；2.每1ml的培養(yǎng)基中加入5-10ul的Polybrene（儲(chǔ)存液濃度為2mg/ml），可 以提高效率約3-5倍。不過(guò)病毒感染效率的問(wèn)題都是相對(duì)的，達(dá)到自己的研究目 的即可。北京英格恩生物公司最新研發(fā)合成一種新型納米聚合物病毒感染增強(qiáng)試劑（病 毒轉(zhuǎn)染試劑）Envirus，具有對(duì)病毒吸附和獨(dú)有的濃縮功能。Envirus通過(guò)物理 作用將病毒大量富集在細(xì)胞表面，大大增加病毒與細(xì)胞的接觸，最大限度促進(jìn)病 毒感染細(xì)胞，可大大提高腺病毒，慢病毒，腺相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒的感 染效率，并且細(xì)胞毒性很小。通常情況下，比不用EnvirusTM增強(qiáng)劑，提高感染效率20-50倍。virus only virus+Polybren