1、小膠質(zhì)細胞人補體攻膜復合物亞溶破模型制作及功能鑒定作者：羅娜，白云，周靜然，宋敏，王艷艷，楊曉亞，許雪青，段文元，熊加祥【關(guān)鍵詞】 C56Preparati on and functional ide ntificati on of sublytic pleme ntmembra ne attack plex on cultured mouse microglia cells【Abstract 】AIM: To establish sublytic membra neattack plex (sMAC) models and ide ntify the sublytic effects on

2、mouse microglia cells in vitro. METHODS: An activated plex of C56 was gen erated by treatme nt of acute phase serum and C7-C9 came from fresh no rmal huma n serum to assemble sMACon cultured microglia cells in vitro. The sublytic dose of sMACwas determined by CCK8assay. SMACeposition was identifiedb

3、y lasercon focal microscope (LSCM). The activity of castoff cells and the cha nge of cell focal adhesion were determined by castoff counting and Trypan blue sta ining assay. ELISA was used to detect the cha nge of NO and TNFasecretion by sMAC. RESULTS: The sublytic dose of MAC was determi ned as C56

4、 1 : 480 and NHS 1 : 20. SMAC deposition on microglia cells was see n un der a LSCM; The nu mber of castoff microglia cells which had no rmal cell abilities was greatly in creased by sMAC pared tocontrols (P 95% 方滿足實驗要求.補體優(yōu)球蛋白C56的提取及活性鑒定急性期患者血清與4 g/L酵母多糖，mmol/L Mg2+37C作用1 h后離心，取血清用微量補體反應性溶血法鑒定補體 C56

5、活性，收集活性樣品用 mol/L PB(pH )透析，所得優(yōu)球蛋白沉淀溶于含100 g/L甘油的mol/L PBS (pH ) 中，即為功能純C56制品.比色實驗確定sMAC亞溶破劑量將小膠質(zhì)細胞以 2X108 /(L ?孔)接種于 96孔培養(yǎng)板，漂洗后，每孔中加入含 1 mmol/L EDTA無血清IMDM養(yǎng)基100卩L, 不同釋度功能純C56 10卩L，37C孵育15 min，再加入1 : 20 NHS 37C孵 育1 h組裝sMAC.每孔中加入10卩L CCK8試劑，37 C 30 min,于450 nm波 長處測定A值.鑒定sMAC小膠質(zhì)細胞上的沉積 將2X 104小膠質(zhì)細胞接種于自制

6、蓋玻 片小室，生長至80%融合，漂洗，加入亞溶破劑量 C56, 37C 15 min ;再加入 EDTANHS冰上孵育60 min于細胞表面組裝sMAC.固定并封閉，加入小鼠抗人1 : 10 sMAC單克隆抗體，同時設(shè)立小鼠抗人 CD3 IgG同型對照和不加一抗陰性 對照，4 C過夜；FITC標記的羊抗小鼠二抗，4 C 1 h,漂洗后磷酸甘油封片， 4 C避光保存，48 h內(nèi)用LSCM觀察.刺激小膠質(zhì)細胞后脫落細胞計數(shù)及細胞存活率細胞分為未刺激，sMAC同濃度C56, 1 : 20 EDTANHS失活sMAC共 5組. 將C56與NHS于 37C提前混合孵育 30 min，使sMAC失活.各組

7、細胞37C孵育24 h，收集溫育液，離心，加少量 培養(yǎng)液重懸，以計數(shù)板計算脫落細胞數(shù)，同時以臺盼藍拒染法，計算細胞存活率.對小膠質(zhì)細胞NO和TNFa合成的影響細胞分組同前，37C孵育12 h，收 集上清，離心后檢測各組 NO與TNFa分泌量.統(tǒng)計學處理：應用SPSS軟件處理，所有數(shù)據(jù)用x±s表示，組間采用t檢驗和方差分析，P1 : 480時,sMAC活性升高，小膠質(zhì)細胞溶破增多；當 C56稀 釋度1 : 480后，sMAC活性降低，小膠質(zhì)細胞溶破減少故確立C56 1 : 480, NHS 1: 20為小膠質(zhì)細胞亞溶破補體量.鑒定sMAC在小膠質(zhì)細胞表面沉積以亞溶破劑量C56及 EDT

8、ANH體外組裝sMAC LSCM觀察可見細胞膜表面sMAC沉積明顯（圖1 ），同時小膠質(zhì)細胞 膜完整性好，形態(tài)無明顯變化，提示所加入的 sMAC是亞溶破劑量的sMAC.圖1激光共聚焦顯微鏡鑒定sMAC組裝LSCM X 200 （略）刺激小膠質(zhì)細胞后脫落細胞計數(shù)及細胞存活率亞溶破劑量sMAC刺激細胞24 h后，細胞脫落增多（P）;臺盼藍染色見sMAC刺激后脫落細胞大多數(shù)為存 活細胞，其余對照組則大部分為死亡細胞（表 1 ）.由此推斷，sMAC可降低細胞 黏附力，而不影響細胞活力.表1sMAC刺激小膠質(zhì)細胞后脫落細胞計數(shù)及細胞存活率（略）aP vs未刺激組、C56單獨組、EDTANH組和失活sMA

9、Cfi.亞溶破sMAC寸小膠質(zhì)細胞NO和TNFa合成的影響5組小膠質(zhì)細胞37C孵育12 h后ELISA檢測上清中NO 與TNFa分泌量.SMACW激后小膠質(zhì)細胞分泌NC與TNFa顯著增高，同各對照 組相差顯著（P，圖2 ）.aP vs未刺激組、C56單獨組、EDTANH組和失活sMACS.圖2sMAC寸小膠質(zhì)細胞分泌炎性因子 NO與TNFa的影響3討論MAC乍為補體激活的終末因子，對不同細胞可產(chǎn)生不同效應，其對細胞的 殺傷功能主要取決于C9結(jié)合量，CD59分子可通過阻礙C9的聚集而調(diào)控MAC勺組裝，是重要的補體膜調(diào)節(jié)蛋白3,同時，有核細胞可通過內(nèi)吞等方式將 MAC 清除，防止細胞溶破補體在進化

10、過程中存在高度保守性，同種和異種間補體可 相互作用，產(chǎn)生不同的刺激效應如Adler等4以NHS和C56分子在大鼠腎 小球系膜細胞上組裝sMAC,刺激細胞活化產(chǎn)生活性氧自由基；Halperin等5 證實人sMAC可促進小鼠3T3細胞細胞有絲分裂和再生增加.我們采用不同濃度 人補體C56與NH鋪C7C9成分體外確定了小鼠小膠質(zhì)細胞 sMAC亞溶破劑量， LSCM僉證sMAC、膠質(zhì)細胞的沉積，成功建立了小膠質(zhì)細胞sMAC亞溶破模型，為后續(xù)功能實驗奠定了基礎(chǔ).sMAC可促進單核/巨噬細胞脂質(zhì)代謝增強，炎癥介質(zhì)和氧自由基大量釋放， 早期可防御外侵、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，而后期則對機體產(chǎn)生損傷.小膠質(zhì)細胞是髓系

11、來源的CNS單核細胞，對神經(jīng)系統(tǒng)炎癥修復及免疫調(diào)節(jié)起重要作用.我們用sMAC刺激小膠質(zhì)細胞后觀察細胞脫落和活力改變，結(jié)果示sMAC能使細胞脫落增 加而活力不受影響，說明sMAC可降低小膠質(zhì)細胞的黏附功能，其機制可能為改 變細胞外基質(zhì)成分，對細胞骨架重排的結(jié)果6 .sMAC刺激小膠質(zhì)細胞12 h后檢測到細胞分泌炎性介質(zhì) NO和TNFa增加，其余對照組中，EDTA抑制補體 活化不產(chǎn)生MAC C56單獨無炎性刺激效應；37E孵育下補體C7C9, S蛋白與 C56可直接結(jié)合形成失活sMAC不能與細胞結(jié)合，各組均無明顯刺激效應.NO和TNFa是CNS炎性病變中重要的致炎因子，NO具有神經(jīng)毒性，可導致 神

12、經(jīng)元的損傷和死亡，TNFa能自分泌促進白細胞浸潤，也可上調(diào)神經(jīng)元MHC表達，更易受毒性T細胞攻擊；并且TNFa的分泌可進一步誘導小膠質(zhì)細胞 NFk B和PKC通路活化，釋放NO花生四烯酸等介質(zhì)促進炎性爆發(fā)7-8 .本 研究顯示sMAC在 CNS炎癥的早期階段可能對小膠質(zhì)細胞有炎性刺激效應，為今 后探討補體在CNS炎性疾病中的發(fā)病機制提供了線索，但就其信號傳導途徑尚待 進一步研究.【參考文獻】1 Cole DS, Morgan BP. Beyond lysis: Howplement influences cell fate J . Clin Sci, 20XX,104 (5):455-466.

13、2 Rus H, Cudrici C, Niculescu F. The Role of the ComplementSystem in Inn ate Immu nity J . Immu nol Res, 20XX,33(2):103-112.3 He C, Imai M, Song H, et al. Complement inhibitors targeted to the proximal tubule prevent injury in experimental nephrotic syndrome and demonstrate a key role for C5b9 J . J

14、 Immunol，20XX,174(9):5750-5757.4 Adler KS, Baker PJ. Johnson RJ, et al. Complementmembraneattack plex stimulates production of reactive oxygen metabolites by cultured ratmesa ngial cells J . J Clin In vest, 1986,77,762-767.5 Halperin JA,Taratuska A, NicholsonWeller A. Terminal pleme nt plex C5b9stimulates mitoge nesis in 3T3 cells J . J Cli n In vest , 1993,91,1974-1978.6 郭嘯華，廖立生.補體攻膜復合體致腎小球