1、實驗二 顯微鏡油鏡的使用及 細菌的簡單染色法 一、實驗目的：一、實驗目的：1.學習并掌握普通光學顯微鏡油鏡的使用技術；2.學習微生物制片、染色的基本技術，掌握細菌的 簡單染色法及無菌操作技術； 3.觀察細菌的基本形態(tài)。 二、實驗原理：二、實驗原理：1、染色原理：、染色原理：用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性 染料和中性染料三大類。染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷堿性染料的離子帶正電荷，能和，能和 帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白質等電點較低，當它生帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白質等電點較低，當它生 長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，

2、所以通長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通 常采用堿性染料（如美藍、結晶紫、堿性復紅或孔雀綠常采用堿性染料（如美藍、結晶紫、堿性復紅或孔雀綠 等）使其著色。等）使其著色。酸性染料的離子帶負電荷酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷，能與帶正電荷 的物質結合。當細菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基的物質結合。當細菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時，細下降時，細 菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等 酸性染料著色。中性染料是前兩者的結合物又稱復合染酸性染料著色。中性染料是前兩者的結合物又稱復合染 料，如伊紅美藍、伊紅天青等。料，如伊紅美

3、藍、伊紅天青等。簡單染色法簡單染色法:是只用一種染料使細菌著色以是只用一種染料使細菌著色以 顯示其形態(tài)的染色法，簡單染顯示其形態(tài)的染色法，簡單染 色不能辨別細菌細胞的構造。色不能辨別細菌細胞的構造。2、顯微鏡油鏡工作原理：、顯微鏡油鏡工作原理： 利用油鏡不但能增加照明度，更主要是能利用油鏡不但能增加照明度，更主要是能增加數(shù)值口增加數(shù)值口 徑徑，因為顯微鏡的放大效能是由其數(shù)值口徑?jīng)Q定的。所，因為顯微鏡的放大效能是由其數(shù)值口徑?jīng)Q定的。所 謂數(shù)值口徑，即光線投射到物鏡上的最大角度（稱為鏡謂數(shù)值口徑，即光線投射到物鏡上的最大角度（稱為鏡 口角）的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質的折射率所口角）的一半正弦

4、，乘上玻片與物鏡間介質的折射率所 得的乘積，可用下列公式表示：得的乘積，可用下列公式表示： NA=nsin NA:數(shù)值孔徑數(shù)值孔徑 n:介質折射率介質折射率 ：鏡口角的半數(shù)：鏡口角的半數(shù) 顯微鏡的分辨率是指顯微鏡能夠辨別顯微鏡的分辨率是指顯微鏡能夠辨別兩點之間最小距離的能力。兩點之間最小距離的能力。它與接物鏡的數(shù)值口徑成正比，與光波長度成反比，因此接物鏡的數(shù)值口徑愈大，光波波長愈短，則顯微鏡的分辨力愈大，被檢物體的細微結構也愈能明顯地區(qū)別出來。 能辨別兩點之間最小距離= 1/2光波長度數(shù)值口徑 = 1/2NA 三三 、實驗器材、實驗器材1、活材料：、活材料： 培養(yǎng)培養(yǎng)18-24h的的金黃色葡萄

5、球菌金黃色葡萄球菌( (S.aureusS.aureus) ) 和枯草芽孢桿菌（和枯草芽孢桿菌（B.subtilisB.subtilis）。）。2、染色液和試劑：、染色液和試劑： 復紅、美蘭、二甲苯、香柏油。復紅、美蘭、二甲苯、香柏油。3、器材：、器材： 載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡。載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡。四、實驗步驟：四、實驗步驟：1、涂片涂片： 取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右各加一滴蒸餾取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右各加一滴蒸餾水，按無菌操作法取菌涂片，左邊涂水，按無菌操作法取菌涂片，左邊涂金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌，右，右邊涂芽孢桿菌，做成薄的涂面，

6、注意取菌不要太多。邊涂芽孢桿菌，做成薄的涂面，注意取菌不要太多。 整個過程中要注意無菌操作。（示范無菌操作技術）整個過程中要注意無菌操作。（示范無菌操作技術） 2、干燥干燥：讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文 火烘干。 3、固定固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上， 通過火焰 2-3次固定（以不燙手為宜）。4、染色染色：將固定過的涂片加復紅或美蘭染色：將固定過的涂片加復紅或美蘭染色1-2min。5、水洗水洗：用水洗去涂片上的染色液。：用水洗去涂片上的染色液。6、干燥干燥：將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。：將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。7、鏡檢鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找

7、出適當?shù)囊曇埃合鹊捅队^察，再高倍觀察，并找出適當?shù)囊曇?后，將高倍鏡轉出，在涂片上加香柏油一滴，將后，將高倍鏡轉出，在涂片上加香柏油一滴，將 油鏡頭浸入油滴中仔細調焦觀察細菌的形態(tài)。油鏡頭浸入油滴中仔細調焦觀察細菌的形態(tài)。8、繪圖：繪圖：簡單染色實驗步驟簡單染色實驗步驟涂片涂片 干燥干燥 固定固定 染色染色 水洗水洗 干燥干燥 鏡檢鏡檢結果與思考題：結果與思考題：1、油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應注意些什么？2、按比例繪出你所觀察到的細菌的形態(tài)，并顯示兩菌的排列 方式。復紅或美藍復紅或美藍1-2min9、實驗完畢后的處理：、實驗完畢后的處理：將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈：將浸過油的

8、鏡頭按下述方法擦拭干凈： a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。 b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦23次。次。 c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦23次。注意擦鏡頭時向一個次。注意擦鏡頭時向一個 方向擦拭。方向擦拭?？春蟮娜旧Ｆ脧U紙將香柏油擦干凈，再用洗衣粉清洗?？春蟮娜旧Ｆ脧U紙將香柏油擦干凈，再用洗衣粉清洗。五、五、結果與思考題結果與思考題1、油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應 注意些什么？ 2、按比例繪出你所觀察到的細菌的形態(tài)，并顯 示兩菌的排列方式。六、注意事項六、注意事項1、油浸物鏡的工作距離（指物鏡前

9、透鏡的表面到被檢物體、油浸物鏡的工作距離（指物鏡前透鏡的表面到被檢物體 之間的距離）很短，一般在之間的距離）很短，一般在0.2mm以內(nèi)，再加上一般以內(nèi)，再加上一般 光學顯微鏡的油浸物鏡沒有光學顯微鏡的油浸物鏡沒有“彈簧裝置彈簧裝置”，因此使用油浸，因此使用油浸物物 鏡時要特別細心，避免由于鏡時要特別細心，避免由于“調焦調焦”不慎而壓碎標本片并不慎而壓碎標本片并使使 物鏡受損。物鏡受損。2、染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應吸去玻片上、染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應吸去玻片上 的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。實驗報告的撰寫要求實驗報告的撰寫要求 實驗報告必須以實事求是、嚴肅認真的科學態(tài)度，按照指實驗報告必須以實事求是、嚴肅認真的科學態(tài)度，按照指導書的要求按時完成。實驗報告應該簡明扼要、敘述準確、數(shù)導書的要求按時完成。