1、苦瓜蛋白抑制腫瘤基質(zhì)金屬蛋白酶的活性及表達(dá)            作者：熊術(shù)道，尹麗慧，李景榮，葉愛芳，章圣輝，溫博貴【摘要】  目的 探討苦瓜蛋白對H22荷瘤小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)及其活性的影響。方法 將清潔級ICR雄性小鼠隨機(jī)分成5組，建立肝癌H22移植瘤模型，分為陰性對照組、高劑量組(T3)、中劑量組(T2)、低劑量組(T1)及陽性對照組（CTX,環(huán)磷酰胺處理組）。在普通飼料飼喂的基礎(chǔ)上采用腹腔注射給藥法分別予陰性對照組生理鹽水；高、中、低劑量組分別給以不同劑

2、量苦瓜蛋白；陽性對照組予環(huán)磷酰胺。觀察苦瓜蛋白對抑瘤率的影響，明膠酶譜法檢測荷瘤小鼠血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的活性及其變化。結(jié)果 苦瓜蛋白組低、中、高劑量組及陽性對照組抑瘤率分別為52.05%、66.89%、85.81及65.10；各苦瓜蛋白干預(yù)組與陰性對照組相比，MMP-2、MMP-9的活性降低，酶原表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，上述作用與苦瓜蛋白劑量相關(guān)。結(jié)論 苦瓜蛋白具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)及其活性的作用，其抗腫瘤作用可能與苦瓜蛋白具有抑制MMPs的活性及其表達(dá)有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  苦瓜蛋白移植性腫瘤抗腫瘤作用基質(zhì)金屬蛋白酶   

3、;Abstract: Purpose To explore effect of Momordin on expression and activity of matrix metalloprotease in murine transplanted tumor(H22). Methods Male mice of ICR species were randomly divided into 5 groups and then constructed the transplantation tumor model of liver cancer H22. The negative control

4、 group were treated by normal saline; T1, T2 and T3 group by Momordin with low, middle and high dose respectively and positive control group by cytoxan (CTX group). All the mice were feeded ordinarily with intraperitoneal drugs administration. Tumor inhibitive rate of Momordin was measured. Activity

5、 of MMP-2 and MMP-9 in serum was detected by Gelatin Zymography. Results Tumor inhibition rate in low, middle and high dose of Momordin and CTX group were 52.05%, 66.89%, 85.81% and 65.10%, respectively. The activity of MMP-2 and MMP-9 significantly decreased in all Momordin treated groups compared

6、to the negative control group (P<0.01). The above function correlated to the dose of Momordin. Conclusion Momordin plays a role of inhibitory effect on the expression and activity of matrix metalloprotease and its anti-tumor activity may be involved in regulating the expression and activity of ma

7、trix metalloprotease.    Key words: Momordin; transplanted tumor; anti-tumor activity; matrix metalloprotease.    苦瓜(momordica charantia) 屬葫蘆科植物，中醫(yī)認(rèn)為其具有消暑滌熱、明目、解毒之功效?？喙系鞍?momordin)是從苦瓜籽中分離出來的一種分子量約為30kD的堿性糖蛋白質(zhì)，屬于型核糖體失活蛋白(ribosome inhibiting protein，RIP)。近年來研究表明RIP具有明顯的抗

8、腫瘤、抗病毒作用，具有極高的藥用價值1，2。本文在前人分離純化RIP的工作基礎(chǔ)上，采用強(qiáng)陽離子交換層析SP Sepharose High Performance為分離介質(zhì)分離純化得到了苦瓜籽蛋白，我們前期的研究表明苦瓜RIP可以明顯誘導(dǎo)K562細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞凋亡3，4。為進(jìn)一步研究苦瓜RIP對動物移植性腫瘤的作用（in vivo）的分子機(jī)制，我們研究了苦瓜蛋白對移植性肝癌H22荷瘤小鼠抑瘤作用及基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制作用，以進(jìn)一步闡明苦瓜蛋白抗腫瘤作用的機(jī)制，為促進(jìn)苦瓜蛋白應(yīng)用于抗腫瘤治療提供理論和實驗基礎(chǔ)。    1   材料與方法 &

9、#160;  1.1   材   料    主要儀器：Image master凝膠成像系統(tǒng)（GE health），垂直電泳儀(Bio-Rad mini-protein)。    主要試劑：丙稀酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、過硫酸銨及TEMED等電泳試劑購置于上海生工生物工程有限公司。    實驗動物與細(xì)胞株：清潔級ICR雄性小鼠，體重18g22g，溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。ICR小鼠H22腹水瘤細(xì)胞由浙江中醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)系惠贈。   

10、; 1.2   方   法    1.2.1   苦瓜蛋白分離與純化5    預(yù)冷梯度丙酮沉淀得到的苦瓜籽粗蛋白經(jīng)SP Sepharose High Performance 陽離子交換層析柱在GE-Health中壓層析系統(tǒng)中分離純化得到苦瓜蛋白。    1.2.2   荷瘤小鼠模型的建立    無菌條件下抽取肝癌小鼠腹水中的H22細(xì)胞，用無菌生理鹽水將收集到的腫瘤細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106

11、/ml，于ICR小鼠左前肢腋下行無菌皮下接種，每只小鼠接種0.2ml細(xì)胞懸液，細(xì)胞總數(shù)為2×105。    1.2.3   實驗動物分組及處理    小鼠接種H22細(xì)胞后24h分組（每組12只），隨機(jī)分為低劑量苦瓜蛋白給藥組（T1，25mg/kg），中劑量苦瓜蛋白給藥組(T2，50mg/kg)和高劑量苦瓜蛋白給藥組(T3，100mg/kg)；另設(shè)陰性對照組(con，給以等量生理鹽水)；陽性對照組（CTX，40mg/kg）。各組均腹腔注射給藥，給藥體積為每只0.2 ml，每天1次，連續(xù)12天。停藥后次日對小

12、鼠進(jìn)行眼靜脈穿刺取血，離心分離血清-20凍存?zhèn)溆谩?#160;   1.2.4   苦瓜蛋白對荷瘤小鼠腫瘤抑制作用    停藥后次日處死小鼠，剝離瘤體稱其質(zhì)量，計算腫瘤生長抑制率(抑瘤率)。抑瘤率=(對照組平均瘤重量-治療組平均瘤重量)×100對照組平均瘤重量。    1.2.5   MMP酶譜檢測6    制備7.5丙稀酰胺凝膠（含0.1明膠），血清120稀釋后加入等量的無還原劑2×SDS上樣緩沖液，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后將膠置于2.5% Triton X-100溶液中室溫?fù)u洗2次，每次15min；加入反應(yīng)液（50mM Tris-HCl (pH 7.5)，150mM NaCl，10mM CaCl2，0.02%NaN3）37孵育過夜。取出凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色并脫色，結(jié)果用Iamgemaster進(jìn)行拍照，結(jié)果分析采用Quantity one 軟件進(jìn)行密度掃描分析。其中：MMP活性表現(xiàn)為深色背景中的白色或淺色條帶。其中相