1、Rb基因產(chǎn)物在大鼠肝細(xì)胞癌變過(guò)程中的異常表達(dá)及意義作者：韓克強(qiáng)，吳婭利，梁平，李靖，王細(xì)文，黃小兵【摘要】 目的 探討肝細(xì)胞癌變過(guò)程中Rb基因產(chǎn)物(Rb蛋白)的異常表達(dá)及其意義。方法 用0.2%二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)Wistar大鼠建立肝癌動(dòng)物模型，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)Rb蛋白在大鼠肝臟癌變及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的表達(dá)。結(jié)果 正常組20只中均見(jiàn)Rb蛋白表達(dá)，肝硬化組21只中有18只Rb蛋白過(guò)表達(dá)，肝癌組（未轉(zhuǎn)移）68只中有37只Rb蛋白過(guò)表達(dá)，肝癌組（伴轉(zhuǎn)移）18只中有3只Rb蛋白過(guò)表達(dá)。結(jié)論 Rb蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率隨病變程度的加重而逐漸降低，這輔證了Rb蛋白在肝細(xì)胞癌形成過(guò)程中發(fā)揮抑癌作用，Rb蛋白的

2、失活可能促進(jìn)肝癌形成，并與肝癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 肝細(xì)胞癌 Rb基因 免疫組化 大鼠Abstract Objective To discuss the abnormal expression of retinoblastoma protein (Rb) gene product in the hepatocellular carcinogenesis and its significance.Methods 0.2% N-nitrosodethylamine (DEN) was applied to induce Wistar rats to form the model of

3、 hepatocellular carcinoma (HCC), and the expression of Rb protein in HCC carcinogenesis and metastasis was detected with immunohistochemical method.Results 20 rats in control group all showed the expression of Rb protein, 18 rats out of the 21 rats in liver cirrhosis group had the expression of Rb p

4、rotein as well as 37 rats out of the 68 rats in HCC (without metastasis) group, and only 3 rats out of the 18 rats in HCC (with metastasis) had the expression of Rb protein.Conclusions Uhe positive expression rate of Rb protein decreases gradually with the aggravation of lesion degree, which may ass

5、ist that Rb protein play an inhibiting role in hepatocellularcarcinoma, its inactivity may promote the genesis of HCC and is closely related to the progress and metastasis of HCC.KEYWORDS hepatocelluar carcinoma Rb gene immunohistochemistry rat近年來(lái)的研究表明，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控是癌變的重要原因。抑癌基因Rb(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因)編碼的蛋白R(shí)b是細(xì)胞周期重

6、要的調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞周期G1到S期中主要起負(fù)調(diào)節(jié)作用，以防止細(xì)胞增殖失控向腫瘤性增生轉(zhuǎn)化。已經(jīng)在人類(lèi)多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)Rb基因的突變或缺失，但其在肝細(xì)胞肝癌(HCC)發(fā)生發(fā)展中的抑癌機(jī)制尚未完全闡明。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)Rb蛋白在肝癌形成及發(fā)展中的作用，我們應(yīng)用二乙基亞硝胺(DEN)構(gòu)建了大鼠肝細(xì)胞癌模型，動(dòng)態(tài)觀察肝細(xì)胞由正常、肝硬化、肝癌到轉(zhuǎn)移這個(gè)過(guò)程中Rb蛋白表達(dá)的變化，來(lái)驗(yàn)證Rb蛋白與腫瘤的關(guān)系，從而為研究腫瘤的基因治療提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)雄性Wistar大鼠140只，910周齡，體重150g±20g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)

7、動(dòng)物中心。1.1.2 試劑和儀器 二乙基亞硝胺(DEN) 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗鼠免疫IgG(Rb蛋白)多克隆抗體多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，S-P免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、抗體稀釋液購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。IX70型相差倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。1.2 方法1.2.1 大鼠肝細(xì)胞癌模型的制備 實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組120只，對(duì)照組20只。實(shí)驗(yàn)組參考文獻(xiàn)方法13，并改進(jìn)方法誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌模型，經(jīng)口咽插管至胃灌喂0.2%二乙基亞硝胺(DEN)溶液，每天1ml，每周連續(xù)灌喂5天，其余2天自由飲水，至第19周完后停止給藥，對(duì)照組以同樣

8、方法灌喂等量生理鹽水。于誘導(dǎo)第16、18、20、22、25周分批行MRI掃描后處死，并解剖觀察肝臟成瘤情況及有無(wú)轉(zhuǎn)移，對(duì)照組同時(shí)處死4只。取部分漂洗后肝臟放于10%中性福爾馬林固定，留做病理學(xué)檢查及免疫組化檢測(cè)，光鏡觀察肝臟病理變化，按大鼠肝腫瘤國(guó)際組織學(xué)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行形態(tài)判定4，并按分化程度分級(jí)。其余肝臟投入液氮備用。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有41只大鼠死亡，對(duì)照組全部存活，實(shí)驗(yàn)組累計(jì)檢測(cè)標(biāo)本107例。1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 石蠟切片按S-P試劑盒要求操作，經(jīng)脫蠟、脫水，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性后，進(jìn)行微波抗原修復(fù)。依次滴加正常山羊血清、一抗(1:200稀釋)、二抗、辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DA

9、B顯色后常規(guī)復(fù)染、脫水、透明、封片，光鏡觀察、拍照。以0.02M PBS代替一抗作陰性對(duì)照，以正常大鼠肝臟切片作陽(yáng)性對(duì)照。1.2.3 免疫組化結(jié)果判定 細(xì)胞染色陽(yáng)性以細(xì)胞核或細(xì)胞漿著棕黃色或棕褐色為準(zhǔn)，染色結(jié)果參照Mark Kelley實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)5進(jìn)行腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性計(jì)分。首先在高倍鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)腫瘤細(xì)胞，避開(kāi)腫瘤邊緣及壞死區(qū)域，根據(jù)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)目所占百分比得出細(xì)胞核或細(xì)胞漿標(biāo)記指數(shù)（Labeling index, LI），即細(xì)胞核或細(xì)胞漿LI陽(yáng)性瘤細(xì)胞數(shù)/1000個(gè)腫瘤細(xì)胞×100%。分為以下四級(jí)計(jì)分：<10%記為0分，10%25%記為1分，25%50%記為2分，&

10、amp;gt;50%記為3分；染色強(qiáng)度按大多數(shù)腫瘤細(xì)胞著色的深淺計(jì)分：陰性記為0分，顯色為黃色（弱陽(yáng)性）記為1分，顯色為棕黃色（中等陽(yáng)性）記為2分，顯色為棕褐色（強(qiáng)陽(yáng)性）記為3分。再將這兩項(xiàng)分值相加的總積分即為免疫組化的陽(yáng)性分度：0分為陰性，記為(-)；12分為弱陽(yáng)性，記為(+)；34分為陽(yáng)性，記為(+)；56分為強(qiáng)陽(yáng)性，記為(+)。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 免疫組化結(jié)果應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05或P<0.01表示差異顯著或非常顯著。2 結(jié)果2.1 肝細(xì)胞癌形成、發(fā)展過(guò)程中的病理變化 Wistar大鼠在誘導(dǎo)16周以前病理主要以肝硬化為主，并

11、出現(xiàn)4例肝細(xì)胞癌（高分化肝癌為主）。誘導(dǎo)第1722周以肝細(xì)胞癌為主，第23周及以后多出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，腹腔內(nèi)可見(jiàn)腫大的淋巴結(jié)，可見(jiàn)肝內(nèi)、門(mén)脈、肺臟及腹腔等處轉(zhuǎn)移，部分有血性腹水。大鼠肝細(xì)胞癌（其中以梁索型和腺樣型居多）病理分級(jí)可分為高分化、中分化及低分化三級(jí)，本組例數(shù)分別為35、29、22例。對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)異常病理改變。見(jiàn)表1。表1 肝細(xì)胞癌形成過(guò)程中的病變統(tǒng)計(jì)（略）2.2 Rb蛋白在不同病變肝組織中的表達(dá) 對(duì)照組20只均表達(dá)Rb蛋白。肝硬化組21只中有18只Rb蛋白過(guò)表達(dá)，陽(yáng)性率為85.7%。肝癌組（未轉(zhuǎn)移）68只中有37只Rb蛋白過(guò)表達(dá)，陽(yáng)性率為54.4%。肝癌組（伴轉(zhuǎn)移）18只中有3只Rb蛋白過(guò)表

12、達(dá)，陽(yáng)性率為16.7%。肝硬化組和肝癌組的Rb蛋白表達(dá)均低于正常組，而肝癌組的Rb蛋白表達(dá)又低于肝硬化組，見(jiàn)表2。表2 Rb蛋白在不同病變肝組織中的表達(dá)（略）四組間比較，234.416，P0.000 Rb蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色，定位在細(xì)胞核。Rb蛋白在正常的肝細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，而在肝硬化及腫瘤組織中Rb蛋白均有不同程度的失表達(dá)。在誘癌過(guò)程中，Rb蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率隨病變程度的加重而逐漸降低，四組間相差非常顯著(P<0.01)。其中肝硬化組表達(dá)稍低，與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，而未轉(zhuǎn)移肝癌組與肝硬化組有非常顯著差異(P<0.01)，伴轉(zhuǎn)移肝癌組

13、中的表達(dá)率最低，與未轉(zhuǎn)移肝癌組相比差異非常顯著(P<0.01)。見(jiàn)表2、圖1、圖2。圖1 Rb蛋白在不同病變肝組織中的表達(dá)（略）圖2 Rb蛋白在不同病變肝組織中的表達(dá)情況（IHC，SP法）（略）A：正常肝組織；B：肝硬化；C：肝癌(未轉(zhuǎn)移)；D：肝癌(伴轉(zhuǎn)移)3 討論 目前，人們對(duì)Rb基因及其表達(dá)產(chǎn)物Rb蛋白的了解日趨成熟。但做為與細(xì)胞周期相關(guān)的抑癌基因，其在肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生發(fā)展中的抑癌機(jī)制尚未完全闡明，Rb蛋白在HCC發(fā)病機(jī)制中與肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系遠(yuǎn)未明確6。Rb基因廣泛存在于各組織中，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化，在去磷酸化狀態(tài)下作用于G1期，阻止G1期向S期轉(zhuǎn)化7,8。R

14、b基因編碼一個(gè)105Kda的功能性蛋白，位于細(xì)胞核內(nèi)，Rb蛋白是一個(gè)廣泛性的腫瘤抑制蛋白，其家族蛋白還包括p107、p130，有一個(gè)“口袋”結(jié)構(gòu)域，包含A和B兩個(gè)功能區(qū)，中間被一段間隔區(qū)隔開(kāi)，它們相互作用，形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制基序9。Rb蛋白的磷酸化降解與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展或預(yù)后相關(guān)10。 本研究結(jié)果顯示Rb蛋白在正常的肝細(xì)胞全部呈陽(yáng)性表達(dá)，而在肝硬化及腫瘤組織中Rb蛋白均有不同程度的失表達(dá)，Rb蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率隨病變程度的加重而逐漸降低，四組間相差非常顯著(P<0.01)，這也輔證了Rb蛋白在肝細(xì)胞癌形成過(guò)程中可能發(fā)揮抑癌作用，Rb蛋白的失活可能促進(jìn)肝細(xì)胞癌形成、發(fā)生、發(fā)展。

15、Rb蛋白在伴轉(zhuǎn)移肝癌組、未轉(zhuǎn)移肝癌組和肝硬化組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別是16.7%(3/18)、54.4%(37/68) 和85.7%(18/21)，相差非常顯著(P<0.01)，這表明Rb蛋白的失活與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，支持Rb蛋白功能缺失主要出現(xiàn)于HCC進(jìn)展期。 值得注意的是，Rb蛋白在伴轉(zhuǎn)移肝癌組中的表達(dá)率為16.7%(3/18)，與未轉(zhuǎn)移肝癌組相比，有顯著差異(P<0.05)，這證實(shí)了其可能促進(jìn)了肝癌的轉(zhuǎn)移和高侵襲性發(fā)展，Rb蛋白有可能成為肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移早期監(jiān)測(cè)的參考指標(biāo)，至于Rb蛋白參與肝癌轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。相信隨著對(duì)Rb蛋白研究的深

16、入，必將揭開(kāi)它在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，而且它也有望成為腫瘤生物治療的一個(gè)預(yù)后判斷的有價(jià)值的生物學(xué)指標(biāo)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 Solt D, Farber E. New priciples for the analysis of chemical carcinogenesisJ. Nature, 1976, 263(5): 701703.2 Williams GM, Gebhardt R, Sirma H, et al. Non-linearity of neoplastic conversion induced in rat liver by low exposures to diethylnitro

17、samineJ. Carcinogenesis, 1993, 14(10): 21492156.3 梁曉俐, 鐘光漢, 左聲鶴. 二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌的病理形態(tài)學(xué)研究J. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 1991, 13(1): 32.4 Sell S, Dunsford HA. Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinomaJ. Am-J-Pathol, 1989, 134(6): 13471363.5 Dong W, Meihua L, Mark Kelley. Human a

18、purinic endonucleasa 1(APE1) expressing and prognostic significance in osteosarcoma: Enhanced sensitivity of osteosarcoma to DNA damaging agents using silencing RNA APE1 expression inhibitionJ. Mol Cancer Ther, 2004, 3(6): 679686.6 王兆文, 彭志海, 唐華美, 等. p16/Rb蛋白表達(dá)及核因子-B活性在肝細(xì)胞肝癌中的意義J. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 84(3): 225228.7 Friend SH, Bernard R, Rogelj S, et al. A human DNA segment with properties of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcomaJ. Nature, 1986, 323(6089): 643646.8 McGee TL, Yandell DW, Dryja TP. Structure and partial genomic sequence of the human retinoblastoma susceptibil