1、微生物學通報Microbiologytongbaoim.ac SEP 20, 2009, 36(9): 13181323© 2009 by Institute of Microbiology, CAS一株DMP 降解菌的分離鑒定及其降解特性金德才 吳學玲*梁任星 代沁蕓 王洋洋 楊宇(中南大學資源加工與生物工程學院湖南 長沙410083)摘要: 從山東省濰坊市污染河流底泥中篩選到 1 株能夠以酞酸酯(Phthalic acid esters, PAEs)為唯一碳源和能源生長的微生物, 命名為 JDC-3, 根據形態(tài)學觀察、生理生化指標測定和分子生物學鑒 定結果, 將該菌株初步鑒定為戴

2、爾福特菌屬(Delftia sp.), 以一對簡并引物, 首次在該屬中擴增出 編碼鄰苯二甲酸雙加氧酶的基因片段。同時以鄰苯二甲酸二甲酯(Dimethyl phthalate, DMP)為目標 測試物, 利用高效液相色譜(HPLC)測定了 JDC-3 的降解性能, 得出該菌對 DMP 降解的最佳條件為: pH 7.08.0、溫度 30°C35°C; 在不同 DMP 初始濃度下研究了該菌的降解動力學, 結果表明當濃 度低于 300 mg/L 時的降解動力學方程為 ln C = 0.06837 t + A, 半衰期為 12.48 h, 當初始濃度不 斷增加, DMP 對 JDC-

3、3 的抑制能力增強, JDC-3 對 DMP 的降解速率不斷下降, 半衰期增大。 關鍵詞: 鄰苯二甲酸二甲酯, 16S rDNA, 高效液相色譜, 降解動力學Isolation, Identification and Degradation Characteristicsof a DMP-degrading StrainJIN De-CaiWU Xue-Ling*LIANG Ren-XingDAI Qin-YunWANG Yang-YangYANG Yu(School of Minerals Processing and Bioengineering, Central South Univer

4、sity, Changsha, Hunan 410083, China)Abstract: A bacterial strain which could grow well on the substrate of PAEs as the sole source of carbonand energy was isolated from contaminated sludge in the river of WeiFang in ShangDong province and it was designated as JDC-3. Based on the morphology, biophysi

5、cal and biochemical properties as well as mo- lecular characteristics, this isolate was preliminarily identified as Delftia sp. A fragment of phthalate dioxy- genase gene was successfully amplified from the genus of Delftia for the first time using a set of degenerate primers. Meanwhile, the degrada

6、tion capability of JDC-3 was determined by HPLC using DMP as test sub- strate. The results showed that the optimal pH and temperature were at 7.08.0 and 30°C35°C respectively. The degradation kinetics of JDC-3 was studied in different initial DMP concentration under optimal condi- tions. T

7、he results indicated that the degradation dynamic equation was ln C = 0.06837 t + A when DMP concentration was lower than 300 mg/L, with half life of 12.48 h. The degradation rate decreased and half life of JDC-3 prolonged as the initial concentration kept on increasing.Keywords: DMP, 16S rDNA, HPLC

8、, Degradation kinetics基金項目：國家自然科學基金項目(No. 30770388)* 通訊 Tel: 86-731-8804873;: xueling0714yahoo 收稿日期：2008-12-17; 接受日期：2009-03-20鄰苯二甲酸酯 (Phthalic acid esters, PAEs), 又名酞酸酯, 是目前世界上生產量大、應用面廣的人 工合成有機化合物, 特別是在塑料工業(yè)中得到廣泛應用。隨著塑料工業(yè)的快速發(fā)展及塑料產品的廣泛應用, PAEs 已普遍存在于大氣, 土壤, 水體中, 成為 無處不在的污染物1。國外已稱它們?yōu)椤暗诙€全球性的 PCB 污染物”。

9、已有研究表明, PAEs 作為環(huán) 境雌激素的典型代表, 能通過食物鏈在生物體內逐漸富集, 且可轉移到下一代, 具有致癌、致畸、破壞 免疫和生殖功能等毒性2, 引起了各國的普遍關注。美國環(huán)境保護署 (EPA)和中國環(huán)境監(jiān)測總站已先后 將該類化合物列為優(yōu)先控制的污染物3,4。由于鄰苯二甲酸酯的水解和光解非常緩慢, 微生物降解是自 然環(huán)境中鄰苯二甲酸酯完全礦化的主要途徑5。目前 分離到的鄰 苯二甲酸酯 降解菌有 Pseudomonassp.6、Bacillus sp.7、Burkholderia sp.8、Rhodococcus rubber9 等 。而 關于利用戴 爾福特菌屬 (Delftia s

10、p.)降解 PAEs 的報道只有 1 篇, 本實驗室分離到一株鄰苯二甲酸酯降解菌 JDC-3, 經初步鑒定為戴爾福特 菌屬(Delftia sp.)的細菌, 并首次在該菌中克隆出編碼鄰苯二甲酸酯雙加氧酶的基因片段。另外, 在最30 min。固體培養(yǎng)基每 1 L 加入 20 g 瓊脂。1.2菌株富集、分離與純化土樣為山東省濰坊市污染河流底泥。從樣品中 稱 10 mg 的污泥于 含 20 0 mg / L 鄰苯二甲酸酯 (DMP、DEP、DBP、DOP 各為 50 mg/L)的 100 mL無機鹽培養(yǎng)液中, 采用梯度壓力法馴化, 30°C 振蕩培養(yǎng) 7 d, 逐 步轉接 至含 240 m

11、 g / L 、 2 80 m g / L 、320 mg/L、360 mg/L、400 mg/L 鄰苯二甲酸酯的無機鹽培養(yǎng)液后, 用接種針蘸取少量菌液, 在 PAEs 固 體平板上劃線, 選擇菌落較大、形態(tài)和顏色各異的菌落轉接到新的固體培養(yǎng)基上劃線, 重復 5 次后,挑取單菌落重新接到富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)。l.3細菌生理生化特性測定生理生化鑒定參考文獻10,11進行。細菌的 16S rDNA 的擴增和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建16S rDNA 擴增和序列測定: 正向引物(FC27)為:1.45-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3;反 向 引 物(RC1492)為: 5-TACGGCTACCTTG

12、TTACGACTT-3。50 L 反應體系中 10×PCR buffer 5 L, 10 mmol/LdNTPs 1 L, 25 mmol/L MgCl2 4 L, 5 U/L Taq 酶0.5 L, 5 pmol/L 引物各 1 L, DNA 模板 4 L, 加ddH2O 補齊 50 L, 擴增程序: 95°C 5 min; 94°C 45 s,55°C 1 min, 72°C 1 min, 30 個循環(huán); 72°C 10 min。取 全部反應液進行瓊脂糖凝膠電泳。用 E.Z.N.A.TM GelExtraction Kit (Om

13、ega)進行膠回收, PCR 純化產物的測序工作由上海生工公司完成。用 Clustal X1.8 軟件 進行全序列比對, 并用 Mega 4 構建系統(tǒng)發(fā)育樹。1.5 細菌鄰苯二甲酸雙加氧酶的擴增及其分析參考 Chao 等12的簡并引物進行細菌鄰苯二甲酸雙加氧酶基因的 PCR 擴增, 正向引物: 5- ACACS CCBCARACSCACAC-3; 反向 引 物 : 5-CTTGTCC TGCTACAGCTCTTG-3。擴增體系如下: 50 L 擴增體系為 10×PCR buffer 5 L, 2.5 mmol/L MgCl2 4 L,10 mmol/L dNTPs 4 L, 3端和

14、5端引物各 1 L, Taqpolymerase 0.5 L, DNA 模板 100 ng 左右, 加 ddH2O至 50 L, PCR 反應條件: 95°C 10 min; 94°C 1 min,56°C 1 min, 72°C 1 min, 35 個循環(huán); 72°C 10 min。電 泳回收 PCR 產物, 將回收純化的 DNA 和 PGM-T 載體相連接, 4°C 過夜。將連接產物轉化到大腸桿菌DH5 感受態(tài)中, 涂布到含有氨芐青霉素(50 g/mL) 瓊脂 LB 平板上進行藍白篩選, 挑白斑做菌落 PCR 確 定, 將陽性克隆

15、子送至上海生工測序, 測序所得序列適降解條件下, 在不同的底物濃度下,解動力學做了初步分析。對該菌的降1 材料和方法1.1 主要試劑和培養(yǎng)基鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二辛 酯(DOP)、鄰苯二甲酸二異辛酯(DIOP)購自中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司 , 含量 99.5%, 甲醇 (分析 純)和乙酸乙酯(分析純)由天津市大茂化學試劑廠生 產, 色譜級甲醇購自美國 Sigma 公司。無機鹽培養(yǎng)基(g/L): K2HPO4 5.8, KH2PO4 4.5,(NH4)2SO4 2.0, MgCl2 0.16, CaCl2 0.02,

16、Na2MoO42H2O 0.0024, FeCl3 0.0018, MnCl2 2H2O 0.0015, pH調至 7.0, 1×105 Pa 滅菌 20 min。固體培養(yǎng)基每 1 L加入 20 g 瓊脂。DMP 無機鹽培養(yǎng)液: 以正己烷配制 10 g/L 的DMP 溶液, 取一定量的 DMP 溶液, 置于滅菌的三 角瓶中, 待正己烷揮完畢加入滅菌的無機鹽基礎培 養(yǎng)液。富集培養(yǎng)基 (g/L): 牛肉膏 5.0, 蛋白胨 10.0,NaCl 5.0, 水 1 L, pH 7.0。培 養(yǎng)基 1×105 Pa 滅菌 1320微生物學通報2009, Vol.36, No.9在 NC

17、BI ( :/ )的非冗余核苷酸序列數據庫進行 Blastx 同源性搜索與分析。1.6 DMP 的生物降解試驗取菌株于 100 mL 活化富集培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12 h24 h, 離心(10000 r/min) 5 min, 收集菌體, 用 pH 7.0, 0.02 mol/L 的 Na2HPO4-NaH2PO4 緩沖液洗 滌 3 次, 用 0.02 mol/L 磷酸緩沖液將菌體配成 pH 7.0、 OD600=0.2 的菌懸液, 吸取 1 mL 菌懸液于含一定 DMP 濃度的 50 mL 無機鹽培養(yǎng)液中, 實驗基本條件 為初始 pH 7.0, 溫度 30

18、6;C, 搖床轉速為 150 r/min, 實驗中固定其中 2 個條件, 改變另一個條件進而確 定最佳的降解條件。以上試驗處理均為 3 次重復。1.7 分析方法1.7.1 樣品處理: 于試樣瓶中加入 20 mL 乙酸乙酯,振蕩萃取 10 min, 收集有機相, 水相再用 20 mL 乙 酸乙酯萃取 2 次, 合并有機相, 旋轉蒸發(fā)儀揮發(fā)后 用甲醇定容至 10 mL, 用高效液相色譜儀測定 DMP 的殘留量。1.7.2 液相色譜條件: 色譜柱 SinoChrom ODS-BP (4.6 mm × 200 mm × 5 m), 柱溫 35°C, 流動相甲醇: 水=90

19、:10, 流速為 0.5 mL/min。檢測器波長為 230 nm, 進樣量為 20 L。圖 1菌株 JDC-3 的掃描電鏡照片(×10000)Fig. 1 Scan electron micrograph of strain JDC-3 (×10000)2.2 菌株 JDC-3 的 16S rDNA 分析采用 PCR 技術, 擴增出 16S rDNA 基因, 測序的序列長度為 1439 bp, 在 GenBank 中的序列登錄號 為 FJ378038。將該序列結果輸入 GenBank 以 Blast 進行序列同源性比較, 結果顯示 16S rDNA 序列與Delftia

20、sp. TS33(EU073099)的親緣關系最近, 相似度為 99%。以 Curvibacter sp. A6 為外群, 構建系統(tǒng) 發(fā)育樹如圖 2 所示, 基本可以判定 JDC-3 屬于戴爾福特菌屬。2.3 細菌鄰苯二甲酸雙加氧酶的克隆及其相關序 列同源性分析測序所得一段長度為 887 bp 的核酸序列, 在GenBank 中的序列登錄號為 FJ528992。根據推定的 氨基酸序列在 NCBI 網站通過 Blastx 進行同源性查詢,結果表明該氨基酸序列和 Terrabacter sp. DBF63、Arthrobacter keyseri 菌鄰苯二甲酸 3,4-雙加氧酶大 亞基(PhtAa

21、)的相似度分別為 86%、85%?；诎被嵝蛄袠嫿ㄏ到y(tǒng)發(fā)育樹, 結果如圖 3 所示。2.4 初始 pH、溫度對 DMP 降解的影響2.4.1 初始 pH 值對菌株 JDC-3 生長及 DMP 降解 率的影響: 在 30°C、搖瓶轉速為 150 r/min 的條件下,考察了 pH 分別為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 時 DMP 作為單一基質情況下的生物降解的情 況, 24 h 測定的實驗結果如圖 4 所示。結果表明 , 在 pH 5.011.0 的范圍內 , 菌株 JDC-3 生長量隨初始 pH 值升高先增加, 在初始 pH 為 7.0 時降解率最大,

22、 達到 51.62%, pH 為 8.0 時降解 率也達到了 49.91%, 而在 pH 為 5.0 時降解率僅為7.73%, 說明 JDC-3 適合在偏堿性的條件下生長, 這可能是由于 DMP 在降解過程中會代謝成鄰苯二甲 酸、原兒茶酸等酸性物質所致。2結果2.1菌株 JDC-3 的分離與部分生理生化測定河流底泥樣品經過 10 次以上轉接培養(yǎng)后, 搖瓶中的混合培養(yǎng)物能夠在 400 mg/L 鄰苯二甲酸酯的無 機鹽培養(yǎng)液中很好的生長, 說明降解菌株在此過程 中得到了富集。經過復篩、純化后篩選得到一株能 以 DMP 為惟一碳源生長的菌株, 命名為 JDC-3。 JDC-3 菌株在 LB 平板上

23、30°C 恒溫培養(yǎng) 1 d 后, 菌 落呈淡黃色、微凸、濕潤、透明、無芽孢。革蘭氏 陰性、VP 反應陰性、甲基紅實驗陰性、接觸酶陽性、 氧化酶陽性、硝酸鹽還原陽性。能夠利用葡萄糖、 果糖、蔗糖、乳糖、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸等。在 顯微鏡下觀察, 細胞初期至后期一直為球狀, 大小 為(0.830.91) m×(0.961.06) m。JDC-3 菌株的電 鏡照片如圖 1 所示。 :/journals.im.ac /wswxtbcn圖 2JDC-3 菌株的 16S rDNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Phylogenetic tree derived from 16S rDNA ge

24、ne sequence of JDC-3 and sequences of relating speciesFig. 2圖 3JDC-3 的鄰苯二甲酸酯雙加氧酶系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of phthalate dioxygenase of strain JDC-32.4.2 溫度對菌株 JDC-3 生長及 DMP 降解率的影響:在 pH 為 7.0、搖瓶轉速為 150 r/min 的條件下, 考察了 25°C、30°C、35°C、40°C、45°C 五種溫度下, DMP 作為單一基質情況下的生物降解的情況

25、, 24 h 后測 定的試驗結果如圖 5 所示。結果 表明 , 在溫 度為 25°C45°C 的范圍 內 ,DMP 的降解率剛開始隨著溫度的升高而增大, 在溫 度為 30°C 時降解率為 52.04%, 35°C 時降解率達到最大為 54.62%, 而后隨著溫度的不斷升高降解率反 而下降, 直到 45°C 時降解率僅為 21.65%, 這表明在30°C35°C 之間最適合 JDC-3 生長, 溫度過低或者 過高都會對該菌的生長產生抑制作用, 從而造成該 菌的降解能力下降。圖 4pH 值對 JDC-3 降解 DMP 的影響Fi

26、g. 4 Effect of pH value on DMP degradation by strain JDC-31322微生物學通報2009, Vol.36, No.9圖 6菌株 JDC-3 對不同初始濃度 DMP 的降解曲線Fig. 6 DMP degradation curve in different initial concen- tration by strain JDC-3圖 5溫度對 JDC-3 降解 DMP 的影響Fig. 5Effect of temperaturestrain JDC-3onDMP degradationby3討論2.5降解動力學在最 適合 pH1) D

27、elftia sp.是一類在有機污染物處理中具有重要價值 的 微生物 , 該 屬降解有 機 物的報道 很 多 , 但是關于該屬菌降解 PAEs 鮮有報道, 本研究從污 染河流底泥中分離純化到 1 株菌, 經形態(tài)學, 生理生化和 16S rDNA 鑒定, 初步鑒定為戴爾福特菌屬 (Delftia sp.), 目前國內還沒有關于該屬菌降解 PAEs 的報道, 這對于擴大國內 PAEs 降解菌資源庫具有一定的意義。2) 鄰 苯二甲酸酯 的生物降解 反應首先由 微生 物酯酶作用水解形成鄰苯二甲酸單酯, 再生成鄰苯二甲酸和相應的醇13。在好氧條件下, 在革蘭氏陽值 和溫度條件 下 , 進行了菌 株JDC

28、-3 對 DMP 的降解動力學研究, 分別配制不同初始濃度(100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、500 mg/L、750 mg/L、1000 mg/L)的 DMP 無機鹽培養(yǎng)基, 每隔6 h 測定 DMP 的降解情況, 結果如圖 6 所示。假設 JDC-3 對 DMP 生物降解反應遵循一級反 應動力學方程, 即: ln(/mg/L) = k t + A , 其中 k 為DMP 降解速率的動力學常數, 為 DMP 的濃度(值 /mg/L), t 為生物降解時間(單位: h) , A 為常數。根 據圖 6 結果, 利用公式可求得表 1 的動力學方程。從表 1 可以看出, 當 DM

29、P 初始濃度小于 300 mg/L時, JDC-3 對 DMP 降解的半衰期相近, 符合降解動 力學方程為 ln C = 0.06837 t + A, 半衰期為 12.48 h, 當初始濃度大于 300 mg/L 時, 降解速率常數 k 值隨初始的鄰苯二甲酸二甲酯濃度增加而降低, 說明高濃度的鄰苯二甲酸二甲酯對其降解有抑制作用, 且 隨鄰苯二甲酸二甲酯初始濃度增加而增加。性菌中,鄰苯二甲酸在鄰苯二甲酸 3,4-雙加氧酶作用下生成 3,4-二羥基鄰苯二甲酸14, 革蘭氏陰性菌中鄰苯二甲酸通過鄰苯二甲酸 4,5-雙加氧酶作用生 成 4,5-二羥基鄰苯二甲酸后15, 均進一步形成原兒茶酸等雙酚化合物

30、, 芳香環(huán)再開裂形成相應的有機 酸, 進而轉化成丙酮酸、琥珀酸、延胡羧酸等進入 三羧酸循環(huán), 最終轉化為 CO2 和 H2O16,17。印度學表 1JDC-3 對不同初始濃度 DMP 生物降解的動力學方程Table 1 DMP degradation kinetics equation in defferent initial concentration by strain JDC-3初始濃度Initial concentration(mg/L)動力學方程Kinetics equation半衰期Half-life(h)相關系數Correlation coefficient(r)10020030

31、05007501000ln C = 0.07192 t+4.78277 ln C = 0.06673 t+5.45141 ln C = 0.06648 t+5.85879 ln C = 0.04950 t+6.46373 ln C = 0.04528 t+6.83319ln C = 0.04411 t+7.2243112.1112.5612.7719.0420.0122.890.957320.973870.977910.948100.964740.96450 :/journals.im.ac /wswxtbcn者 Neelakanteshwar 等人18報道 DBP 在 Delftia sp.

32、TBKNP-05 菌的降解下是通過鄰苯二甲酸 4,5-雙加 氧酶的作用生成 4,5-二羥基鄰苯二甲酸。但在本研 究中, 以一對簡并引物首次在 Delftia sp. JDC-3 中擴增出基因片段, 在 NCBI 中進行同源性分析, 發(fā)現該片段推導的氨基酸序列與 Terrabacter sp. DBF63、Arthrobacter keyseri 菌鄰苯二甲酸 3, 4 雙加氧酶大 亞基(PhtAa)的相似度分別為 86%、85%。而與革蘭氏陰性菌中的鄰苯二甲酸 4,5-雙加氧酶并沒有同源性, 該結果與目前國際上普遍認為的代謝途徑不相 一致, 預示著在鄰苯二甲酸到原兒茶酸這一關鍵步驟中, 革蘭氏

33、陰性菌也可能存在著和革蘭氏陽性菌相同的降解途徑, 明確的結論需要進一步驗證, 這是首 次從分子水平上得出的與現有途徑不一致的結論。3) 在不同初始濃度的條件下, 首次以 DMP 為 唯一碳源, 研究了 Delftia sp. JDC-3 的降解動力學,結果表明當濃度低于 300 mg/L 時, 該菌的降解速率 基本一致, 當濃度超過 300 mg/L 時, 隨著濃度的不斷增加, 降解速率逐漸減小, 說明高濃度的 DMP 對Delftia sp. JDC-3 有一定的毒害作用, 延長了該菌的 適應期。disrupting chemical di-n-butylphthlate ester by

34、Pseudo-monas fluorescens B-1. Int Biodeterior Biodegrad, 2005,55(1): 915.Quan CS, Liu Q, Tian WJ, et al. Biodegradation of an endocrine-disrupting chemical, di-2-ethylhexylphthlate by Bacillus subtilis No.66. Appl Microbiol Biotechnol, 2005,66(6): 702710.Chang HK, Zylstra GJ. Novel organization of t

35、he genes for phthalate degradation from Burkholderia cepacia DBO1. J Bacterio, 1998, 180(24): 65296537.李 俊, 舒為群, 陳濟安, 等. 降解 DBP 菌株 CQ0302的分離鑒定及其降解特性. 中國環(huán)境科學, 2005, 25(1):4751.布坎南 RE, 吉本斯 NE. 伯杰細菌鑒定手冊. 第八版. 中國科學院微生物研究所伯杰細菌鑒定手冊編譯組 譯. 北京: 科學出版社, 1984.東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊. 北京: 科學 出版社, 2001.Chao WL, Lin

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