1、銀杏葉提取物對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞NFB表達(dá)和NO生成的調(diào)控         08-05-08 10:15:00     作者：張申，李曉陽，衛(wèi)濤濤    編輯：studa20【摘要】  目的 研究銀杏葉提取物（EGb761）對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子B（NFB）表達(dá)和可誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、一氧化氮（NO）生成的影響。方法 以脂多糖（LPS）和佛波酯（PMA）誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)可誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、產(chǎn)生大量NO

2、，應(yīng)用激光共聚焦成像系統(tǒng)和NO熒光探針監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)NO濃度變化，逆轉(zhuǎn)錄基因擴(kuò)增技術(shù)和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測EGb761對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中iNOS基因表達(dá)的影響，并探討這一調(diào)控作用的分子機(jī)制。結(jié)果 EGb761能明顯降低C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)、減少NO的生成，抑制IB的降解和阻止p65/RelA進(jìn)入細(xì)胞核。結(jié)論 EGb761可通過NFB信號(hào)通路對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞iNOS基因表達(dá)和NO的生成進(jìn)行調(diào)控。 【關(guān)鍵詞】  銀杏葉提取物；膠質(zhì)瘤細(xì)胞；可誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；一氧化氮；核轉(zhuǎn)錄因子B    Regulatory Effect of Gink

3、go Biboba Extract on the Expression of NFB and Nitroxide Production in Glioma Cells     Key words：EGb761; Glioma cell；  iNOS;  Nitric oxide;  NFB    銀杏為最古老的中生代孑遺稀有植物之一，屬裸子植物門銀杏綱銀杏科植物，現(xiàn)僅存一科一屬一種，有裸子植物“活化石”之稱。銀杏樹的根、葉、皮及種子均可藥用。銀杏葉入藥始于明代，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)用銀杏葉治療哮喘、支氣管炎

4、和老年性心血管疾病，但葉中含有氫氰酸，可加速心率，副作用大。20世紀(jì)60年代后，德、法等歐洲國家先后開展了對(duì)銀杏葉的研究。1965年，德國威瑪舒培博士(Dr. Willmar Schwabe)藥廠正式上市全球第一個(gè)銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)提取物EGb761（ginkgo biloba extract），其質(zhì)量指標(biāo)為黃酮苷24%，萜內(nèi)酯6%，銀杏酸10ppm，此標(biāo)準(zhǔn)為許多國家所公用。但國際上并沒有制定正式統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，也沒有統(tǒng)一的含量測定方法，各廠商都有自己的質(zhì)控指標(biāo)，且不同的地區(qū)、不同的季節(jié)、不同的加工方法和不同的制劑工藝對(duì)銀杏葉中藥效成分影響很大。    資料表明銀杏葉含有多種

5、藥用活性成分，其有效成分主要是銀杏內(nèi)酯和黃酮類(以槲皮素、山奈素、水楊梅素為主)1。近年來，生物類黃酮抗氧化活性倍受人們的重視，生物類黃酮是最強(qiáng)的抗氧化劑之一。且分子較小，水溶性強(qiáng)，易被機(jī)體吸收，無蓄積作用，能清除自由基，提高超氧化物歧化酶（SOD）的活性，抗細(xì)胞凋亡24；調(diào)節(jié)器官組織功能，有效延緩衰老5。已有研究發(fā)現(xiàn)EGb761能抑制巨噬細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞中iNOS基因表達(dá)6。本研究擬以LPS和PMA誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的C6細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用激光共聚焦、RTPCR、Western blot分析等技術(shù)研究EGb761對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞NFB表達(dá)和NO生成的調(diào)控。    1

6、  材料和方法    1.1  材料  實(shí)驗(yàn)試劑主要有：C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone公司）； UNIQ10柱式總RNA提取純化試劑盒（上海生工公司）；Access QuickTM RTPCR試劑盒（Promega公司）等；EGb761（法國Beaufour Ipsen 制藥公司MarieTherses DroyLefaix博士惠贈(zèng)）。    實(shí)驗(yàn)儀器有：CO2培養(yǎng)箱（Napco，USA）；紫外分光光度計(jì)（Beckman，USA）；電泳儀（EPS

7、301，USA）；PCR儀（Eppendorf，Germany）；凝膠成像系統(tǒng)（UVP，USA）；激光共聚焦掃描熒光顯微鏡（Olympus，Japan）等。    1.2  細(xì)胞培養(yǎng)  將復(fù)蘇的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞混懸于DMEM培養(yǎng)基中（含10%滅活胎牛血清，100U/ml青霉素，100g/ml鏈霉素），置37、含5%  CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長成單層后（約3d）按14傳代。    1.3  細(xì)胞內(nèi)NO水平檢測  將處于對(duì)數(shù)生長期的C6細(xì)胞用0.1%的胰酶消化，用含10%胎牛血清的

8、培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，配成1×105的細(xì)胞懸液，接種于4cm培養(yǎng)皿中，每皿2ml，貼壁2h后換成無血清培養(yǎng)基，分為3組，即對(duì)照組、誘導(dǎo)組（LPS 1g/ml和PMA  400ng/ml）和藥物組（在加入LPS和PMA前2h加EGb761 50g/ml），12h后換成帶DAF2DA探針（2.5 mol/L）的培養(yǎng)基，培養(yǎng)1h，用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，置顯微鏡下觀察，激發(fā)波長488nm。    1.4  亞硝酸鹽測定  細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，1×105/孔，分為對(duì)照組、誘導(dǎo)組和藥物組3組，對(duì)照組不加誘導(dǎo)劑和藥物，誘導(dǎo)組加入誘

9、導(dǎo)劑LPS（終濃度1g/ml）和PMA（終濃度400ng/ml），藥物組在加入誘導(dǎo)劑前2h先加入EGb761（終濃度50g/ml），取上清培養(yǎng)液加入等量Griess試劑，室溫放置10min，用Bekman DU640可見紫外分光光度計(jì)，在546nm處測定其吸光度A值，以亞硝酸鈉為標(biāo)準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出亞硝酸鹽的含量，并換算成nmol/L×105個(gè)細(xì)胞。    1.5  RTPCR分析  分別提取各組總RNA，RTPCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增以分析iNOS基因的mRNA表達(dá)，actin為內(nèi)參物。PCR引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)7，由上海生工公司合成。引

10、物序列如下：iNOS：5AGA GAG ATC CGG TTC ACA3/ 5CAC AGA ACT GAG GGT ACA3， 擴(kuò)增片段長度376bp；actin： 5TCC TTC GTT GCC GGT CCA CA3/5CGT CTC CGG AGT CCA TCA CA3，擴(kuò)增片段長度509bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，UVP掃描分析。    1.6  蛋白質(zhì)印跡分析  用細(xì)胞刮刀將各組細(xì)胞刮下，離心收集，加入細(xì)胞裂解液A(細(xì)胞膜裂解)，混勻后冰浴15min，13000g離心15min，上清作為胞漿蛋白提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，用于分析iNOS基因的表達(dá)水平以及檢測IB的降解；沉淀用細(xì)胞裂解液A洗1次，混懸于細(xì)胞裂解液B(細(xì)胞核裂解)，混勻后20冷凍過夜，13000g離心15min，上清作為核蛋白提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，用于分析NFB p65/Rel A亞基的轉(zhuǎn)運(yùn)入核。    用Bradford法分別測定胞漿蛋白和核蛋白濃度。取胞漿蛋白40g、核蛋白20g，以8% SDSP