1、各種酶切位點的保護堿基酶不同，所需要的酶切位點的保護堿基的數(shù)量也不同。一般情況下，在酶切位點以外多出3個堿基即可滿足幾乎所有限制酶的酶切要求。在資料上查不到的，我們一般都隨便加 3個堿基做保護。寡核苷酸近末端位點的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments（oligonucleotides）為了解不同內(nèi)切酶對識別位點以外最少保護堿基數(shù)目的要求，NEB采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進行實驗。實驗結(jié)果對于確定雙酶切順序?qū)袔椭ū热缭诙嘟宇^ 上切割位點很接近時），或者當(dāng)切割位點靠近DNA末端時也很有用。在本表中沒有列出的酶，則通

2、常需在識別位點兩端至少加上6個保護堿基，以確保酶切反應(yīng)的進行。實驗方法：用y32PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下標(biāo)記0.1A 260單位的寡核苷酸。取1 Q已標(biāo)記了的寡核苷酸與 20單位的內(nèi)切酶，在 20° C條件下分別反應(yīng)2小時和20小時。反應(yīng)緩沖液 含 70 mM Tris-HCI （pH 7.6）, 10 mM MgCI 2 , 5 mM DTT 及適量的 NaCl 或 KCI （視酶的具體要求而 定）。20%的PAGE （ 7 M尿素）凝膠電泳分析，經(jīng)放射自顯影確定酶切百分率。本實驗采用自連接的寡核苷酸作為對照。若底物有較長的回文結(jié)構(gòu)，切割效率則可能因為出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而降低

3、。1酶寡核苷酸序列鏈長切割率%2 hr20 hrAcc IG GTCGAC C800CG GTCGAC CG1000CCG GTCGAC CGG1200Afl IIIcacatgt g800ccacatgt gg10>90>90ccc acatgt ggg12>90>90Asc IGGCGCGCC8>90>90AGGCGCGCC T10>90>90TTGGCGCGCC AA12>90>90nAva ICCCCGGG G850>90CC CCCGGG GG10>90>90TCC CCCGGG GGA12>90&g

4、t;90BamH ICGGATCC G81025CG GGATCC CG10>90>90CGC GGATCC GCG12>90>90、Bgl IICAGATCT G800GAAGATCT TC1075>90GGA AGATCT TCC1225>90-BssH IIGGCGCGC C800AG GCGCGC CT1000TTG GCGCGC CAA1250>90BstE IIG GGT(A/T)ACC C9010BstX IAACTGCAGAA CCAATGCATTGG2200AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA242550CTGCAGA

5、A CCAATGCATTGG ATGCAT2725>90Cla ICATCGAT G800GATCGAT C800CC ATCGAT GG10>90>90CCC ATCGAT GGG125050jEcoR IG GAATTC C8>90>90CG GAATTC CG10>90>90CCG GAATTC CGG12>90>90-Hae IIIGG GGCC CC8>90>90AGC GGCC GCT10>90>90TTGC GGCC GCAA12>90>90Hi nd IIICAAGCTT G800CC A

6、AGCTT GG1000CCC AAGCTT GGG121075Kpn IGGGTACC C800GG GGTACC CC10>90>90CGG GGTACC CCG12>90>90Mlu IGACGCGT C800CGACGCGT CG102550Nco ICCCATGG G800CATG CCATGG CATG145075Nde ICCATATG G800CC CATATG GG1000CGC CATATG GCG1200GGGTTT CATATG AAACCC1800GGAATTC CATATG GAATTCC2075>90GGGAATTC CATATG G

7、AATTCCC2275>90Nhe IGGCTAGC C800CG GCTAGC CG101025CTAGCTAGC TAG121050Not ITTGCGGCCGC AA1200ATTT GCGGCCGC TTTA161010AAATAT GCGGCCGC TATAAA201010ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT242590AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA2825>90Nsi ITGC ATGCAT GCA1210>90CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT22>90>90Pac ITTAATTAA800

8、GTTAATTAA C10025CC TTAATTAA GG120>90Pme IGTTTAAAC800GGTTTAAAC C10025GG GTTTAAAC CC12050AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG2475>90Pst IGCTGCAG C800TGCA CTGCAG TGCA141010AACTGCAG AACCAATGCATTGG22>90>90AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA24>90>90CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT2600Pvu ICCGATCG G800ATCGATCG A

9、T101025TCG CGATCG CGA12010Sac ICGAGCTC G81010Sac IIGCCGCGG C800TCC CCGCGG GGA1250>90Sal IGTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC2800GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG301050ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA321075Sca IGAGTACT C81025AAAAGTACT TTT127575Sma ICCCGGG6010CCCCGGG G8010CC CCCGGG GG101050TCC CCCGGG GG

10、A12>90>90Spe IGACTAGT C810>90GG ACTAGT CC1010>90CGG ACTAGT CCG12050CTAG ACTAGT CTAG14050Sph IGGCATGC C800CAT GCATGC ATG12025ACAT GCATGC ATGT141050Stu IAAGGCCT T8>90>90GA AGGCCT TC10>90>90AAAAGGCCT TTT12>90>90Xba ICTCTAGA G800GC TCTAGA GC10>90>90TGC TCTAGA GCA1275&

11、gt;90CTAG TCTAGA CTAG1475>90Xho ICCTCGAG G800CC CTCGAG GG101025CCG CTCGAG CGG121075Xma ICCCCGGG G800CC CCCGGG GG102575CCC CCCGGG GGG1250>90TCCC CCCGGG GGGA14>90>902. 雙酶切的問題參看目錄，選擇共同的 buffer。其實，雙酶切選哪種 buffer是實驗的結(jié)果，takara 公司從1979 年開始生產(chǎn)限制酶以來，做了大量的基礎(chǔ)實驗，也積累了很多經(jīng)驗，目錄中所推薦的雙酶切buffer完全是依據(jù)具體實驗結(jié)果得到的

12、。有共同buffer的，通常按照常規(guī)的酶切體系，在37 C進行同步酶切。但BamH I在37 C下有時表現(xiàn)出star活性，常用30 C單切。兩個酶切位點相鄰或沒有共同buffer的，通常單切，即先做一種酶切，乙醇沉淀，再做另一種酶切。3. 酶切底物 DNA ，切不開1 ）底物 DNA 上沒有相應(yīng)的限制酶識別位點，或酶切位點被甲基化。2 ）PCR 引物的酶切位點前沒有保護堿基或引物合成有誤，致使沒有正確的酶切位點存在。 PCR 產(chǎn) 物酶切前盡量進行精制以更換 buffer 。由于 PCR 產(chǎn)物中帶入的其它物質(zhì)，會影響酶切，據(jù)報道， 通常 PCR 產(chǎn)物的添加量占總反應(yīng)體積 25% 以下沒有問題。3

13、 ）酶切條件的確認(rèn)，包括反應(yīng)溫度和反應(yīng)體系等。同樣的 DNA ，同樣量，用不同的限制酶切情況 可能不同，由于 DNA 的空間結(jié)構(gòu)造成的。同樣的 DNA ，不同的反應(yīng)體系，酶切效果也可能不同， 由于一些空間因素或不可測因素造成的。4 ）公司出售的限制酶都是液體狀態(tài)， 都是根據(jù)最佳反應(yīng)體系配制了濃度， 不可以再用 buffer 稀釋， 因為酶濃度和活性之間不呈直線對應(yīng)關(guān)系，酶濃度越稀，相對活性越低，并且越不穩(wěn)定，有時便會 出現(xiàn)底物 DNA 不能被切斷的現(xiàn)象。不同公司的酶和 buffer 不要交叉使用，否則可能會影響酶切效果。5 ）酶的識別位點上的堿基被甲基化?？梢赃x用不受甲基化影響的同裂酶，或?qū)①|(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)入甲基 化酶欠損的宿主菌中，重新制備 DNA ，也可以使用 PCR 的方法對 DNA 進行擴增，再做酶切。 常用 的有 XbaI 容易受甲基化影響，通常選用 GM33 做宿主菌轉(zhuǎn)化。6 ）底物不純，含有限制酶阻害物質(zhì)，影響酶切作用，需要重新純化 DNA 。一般做乙醇沉淀純化即 可。如果質(zhì)粒中含鹽或酚等，都會影響酶切效果。4. DNA 經(jīng)酶切后，電泳無帶或出現(xiàn) smea