1、實驗七 測定細菌生長曲線一、 實驗目的1. 了解細菌生長曲線特征，測定細菌繁殖的代時；2. 學習液體培育基的配制以及接種方法；3. 反復練習無菌操作技術；4. 了解不同細菌，不同接種方法在同一培育基上生長速度的不同；5. 掌握利用細菌懸液混濁度間接測定細菌生長的方法二、 實驗原理將肯定量的細菌接種在液體培育基內，在肯定條件下培育，可觀察到細菌的生長繁殖有肯定的規(guī)律性，如以細菌的活菌數的對數作縱坐標，以培育時間作橫坐標，可繪成一條曲線，成為生長曲線（如圖一）。 圖一 微生物生長曲線示意圖單細胞微生物的發(fā)酵具有四個階段，即調整期（延滯期）、對數期（生長旺盛期）、平衡期（穩(wěn)定期）、死亡期（衰亡期）。

2、生長曲線可表示細菌從開頭生長到死亡的全過程的動態(tài)。不同的微生物有不同的生長曲線，同一種微生物在不同的培育條件下，其生長曲線也不一樣。因此，測定微生物的生長曲線對于了解和掌握微生物的生長規(guī)律是很有幫助的。測定微生物生長曲線的方法很多，有血球計數板法、平板菌落計數法、稱重法和比濁法等。本實驗接受比濁法測定，由于細菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用分光光度計測定細菌懸液的光密度來推知菌液的濃度。將所測得的光密度值（OD600）與其對應的培育時間作圖，即可繪出該菌在肯定條件下的生長曲線。注意，由于光密度表示的是培育液中的總菌數，包括活菌與死菌，因此所測定的生長曲線的衰亡期不明顯。從生長曲線我們可

3、以算出細胞每分裂一次所需要的時間，即代時，以G表示。其計算公式為： 式中t1和t2為所取對數期兩點的時間；W1和W2分別為相應時間測得的細胞含量（g/L）或OD。三、 實驗儀器、材料和用具1. 實驗材料:大腸桿菌，枯草桿菌菌液及平板；2. 培育基:牛肉膏蛋白胨葡萄糖培育基3. 實驗儀器:取液器(5000ul, 1000ul 各一支);培育箱, 搖床，722s分光光度計；4. 實驗用具:無菌1000ul吸頭80個;無菌5000ul吸頭2個;比色皿9個+共用參比杯一個.四、 實驗步驟1. 籌備菌種：將細菌接種到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培育基中，37振蕩培育18h，另外籌備單菌落平板各1塊2. 分為

4、三個小組： 第（1）小組取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培育基, 37 200rpm取3.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培育基，37 200rpm取5.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培育基，37 200rpm第（2）小組 取一個大腸桿菌菌落接種到100ml培育基， 37 200rpm取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培育基，37 110rpm取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培育基， 30 200rpm第（3）小組 取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培育基， 37 200rpm取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培育基， 30 200rpm取1.0ml枯草桿菌接種到1

5、00ml培育基， 37 110rpm每培育一小時取樣一次(2.5h,3.5h加測1次). 對比組測量起始pH,全部瓶子測量發(fā)酵9h結束測pH. 3. 測量：選用600nm波長，以蒸餾水作為參比，開頭培育前測定每組培育液的OD值作為起始點。開頭培育后，每小時吸取測定一次OD值。 五、 實驗結果及分析1. 實驗數據：表一 三個小組時間-OD數據開頭取樣時間10:5512:0112:3913:1713:53結束取樣時間9:5511:0112:0912:4713:2313:59發(fā)酵時間0122.533.5ODt大腸桿菌單菌落0.0040.0240.0270.0270.0250.03637110rpm-

6、0.0100.0490.1640.2550.3120.32730200rpm-0.0100.0430.0880.1580.2420.3611.0mL0.0100.0700.1580.2660.3720.4363.0mL0.0390.0960.2570.3730.4200.4515.0mL0.0670.1340.3020.3610.3340.456枯草桿菌37200rpm0.0080.0230.0760.1320.1840.25430200rpm0.0130.0320.0520.0880.0910.12537110rpm0.0070.0170.0980.1300.2300.253OD=ODt-O

7、D0大腸桿菌單菌落0.0040.0200.0230.0230.0210.03237110rpm-0.0100.0590.1740.2650.3220.33730200rpm-0.0100.0530.0980.1680.2520.3711.0mL0.0100.0600.1480.2560.3620.4263.0mL0.0390.0570.2180.3340.3810.4125.0mL0.0670.0670.2350.2940.2670.389枯草桿菌37200rpm0.0080.0150.0680.1240.1760.24630200rpm0.0130.0190.0390.0750.0780.1

8、1237110rpm0.0070.0100.0910.1230.2230.246開頭取樣時間14:2915:3516:4317:5018:5719:0720:12結束取樣時間14:3515:4316:5017:5719:0920:0721:12發(fā)酵時間45678910ODt大腸桿菌單菌落0.0650.2670.3950.4540.45737110rpm0.3330.3400.3420.3600.36230200rpm0.4390.5660.5700.5880.5861.0mL0.4640.4460.4460.4580.4403.0mL0.4870.4700.4570.4830.4585.0mL

9、0.4690.4570.4640.4820.478枯草桿菌37200rpm0.3370.4280.5170.5900.6860.7110.71130200rpm0.1710.2610.3700.5400.6280.6060.65237110rpm0.2950.3020.3050.3050.3520.3520.378OD=ODt-OD0大腸桿菌單菌落0.0610.2630.3910.4500.45337110rpm0.3430.3500.3520.3700.37230200rpm0.4490.5760.5800.5980.5961.0mL0.4540.4360.4360.4480.4303.0m

10、L0.4480.4310.4180.4440.4195.0mL0.4020.3900.3970.4150.411枯草桿菌37200rpm0.3290.4200.5090.5820.6780.7030.70330200rpm0.1580.2480.3570.5270.6150.5930.63937110rpm0.2880.2950.2980.2980.3450.3450.3712. 作圖、簡要分析及代時計算：1） 取一個大腸桿菌菌落接種到100ml培育基， 37 200rpm圖一 單菌落大腸桿菌生長曲線 這條曲線屬于比較標準的“S”形曲線，很容易看出調整期和對數期，由于單菌落菌較少，而且從固體培

11、育基轉移至液體培育基環(huán)境變化較大，所以消失了長達4小時的調整期，但可以看出，調整期之后這瓶菌都生長良好。計算代時：取培育4小時到5小時之間的數據（對數生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2t1=1h W1=0.061 W2=0.263代時 2） 取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培育基，37 110rpm 圖二 大腸桿菌菌生長曲線（取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培育基，37 110rpm）接種后幾乎沒有調整期消失，大腸桿菌很快適應了新的環(huán)境并開頭呈指數增長，估量是新的培育環(huán)境和原有環(huán)境較全都，而且在培育最初的時候溶氧和酸堿度都較為適宜，但是這瓶菌是穩(wěn)定期OD最小的，估量是培育基最

12、初分裝不均產生的。計算代時：取培育2小時到2.5小時之間的數據（對數生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2t1=0.5h W1=0.174 W2=0.265代時 3） 取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培育基，30 200rpm圖三 大腸桿菌生長曲線（取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培育基，30 200rpm）可以看出溫度對大腸桿菌適應環(huán)境產生了肯定的影響，使它在調整期滯留了較長的時間，且在對數期增長較慢，應該是酶活性對細胞復制的影響所致。計算代時：取培育2.5小時到3.5小時之間的數據（對數生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2t1=1h W1=0.168 W2=0.371代時

13、 4） 取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培育基, 37 200rpm圖四 大腸桿菌生長曲線（取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培育基, 37 200rpm）這是大腸桿菌培育的最適調節(jié)，可以看出其生長良好，調整期較短，對數期較長。計算代時：取培育2小時到3小時之間的數據（對數生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2t1=1h W1=0.148 W2=0.362代時 5） 取3.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培育基，37 200rpm 圖五 大腸桿菌生長曲線（取3.0ml大腸桿菌接種到100ml培育基，37 200rpm）接種量的增加沒有產生太大的影響，生長曲線沒有太大變化。計算代時

14、：取培育2小時到2.5小時之間的數據（對數生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2t1=0.5h W1=0.218 W2=0.334代時 6） 取5.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培育基，37 200rpm圖六 大腸桿菌生長曲線（取5.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培育基，37 200rpm）3小時消失了一次明顯的波動，應該是測量過程中沒有搖勻的結果，忽視它之后，這條生長曲線屬于正常形態(tài)，比較前兩天生長曲線，發(fā)現5mL得到的最大OD反而減小了，說明在肯定量的培育基下，初始接種量對最后結果影響不大。最大OD應該是受到了最初添加培育基的影響。計算代時：取培育1小時到2小時之間的數據（對數生

15、長期）來計算代時。由代時計算公式，t2t1=1h W1=0.067 W2=0.235代時 7） 取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培育基， 37 200rpm圖七 枯草桿菌生長曲線（取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培育基， 37 200rpm）枯草桿菌的生長曲線包含了調整期、對數期和很小一部分穩(wěn)定期，雖然穩(wěn)定期很短，但是已經可以看出停止生長的趨勢，說明枯草桿菌的代時較長。計算代時：取培育3小時到4小時之間的數據（對數生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2t1=1h W1=0.176 W2=0.246代時 8） 取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培育基， 30 200rpm圖八 枯草桿

16、菌生長曲線（取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培育基， 30 200rpm）溫度降低后，生長變得緩慢了，最后達到的最大OD也更小了，代時加長。計算代時：取培育4小時到5小時之間的數據（對數生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2t1=1h W1=0.158 W2=0.248代時 9） 取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培育基， 37 110rpm圖九 枯草桿菌生長曲線（取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培育基， 37 110rpm）4小時時，似乎由對數期進入了穩(wěn)定期，但是對比前兩組數據，此時的OD值明顯偏小，所以分析，可能此時突然有外因影響，使細胞進入了調整期，可以看到后來7、8小時左右

17、細菌又有增長趨勢。計算代時：取培育2.5小時到3小時之間的數據（對數生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2t1=1h W1=0.123 W2=0.223代時 3. 發(fā)酵結束pH對比組pH=7.5實驗結束后全部瓶pH均小于6.4pH全部降低，說明大腸桿菌和枯草桿菌發(fā)酵均產生了酸。4. 分析表二 不同環(huán)境和菌種生長比較培育菌接種量培育溫度/ 搖床轉速/rpm生長曲線狀態(tài)代時/min調整期/h對數期/h穩(wěn)定期OD(取8小時OD）大腸桿菌單菌落37200430.45328.5 1.0mL37110130.37249.4 1.0mL30200230.59652.5 1.0mL37200130.4304

18、6.5 3.0mL37200120.41948.7 5.0mL37200120.41133.1 枯草桿菌1.0mL37200260.67866.5 30200350.61592.2 37110130.34534.9 1） 接種量對微生物的影響：預期：接種量大，調整期縮短，對數期增長，穩(wěn)定期OD增大，代時縮短。緣由：接種量大的細胞基數大，因而更快適應環(huán)境。實際：調整期影響不大，對數期稍有縮短，穩(wěn)定期OD減小，代時規(guī)律不明顯。分析：生長曲線受各種因素調節(jié)，這里實驗結果不同于預期應該是受到培育基的限制，接種量大對氧氣和原料需求更多，而且產生酸的速度也快，也許對后來的細胞生長造成了肯定的影響。2） 培

19、育溫度對微生物的影響預期：最適溫度下細胞生長應該最快，調整期最短，穩(wěn)定期OD最大，代時最短緣由：溫度影響細菌內酶活力和細胞膜的通透性，進而影響新陳代謝，從而影響細菌的生長繁殖。最適溫度下，細菌酶活性最強，因而能最快適應環(huán)境，并取得生長增殖的最高效率。實際：大腸桿菌37穩(wěn)定期OD最大，調整期更短，但代時更長?？莶輻U菌37調整期更短，對數期更長，穩(wěn)定期OD更大，代時更短。分析：大腸桿菌代時的問題應該來自實驗誤差，如取樣未搖勻、計算時取點不夠精確，或實驗過程中某些操作導致生長和理論不全都。3） 搖床轉速對微生物的影響預期：轉速高，調整期短，對數期長，穩(wěn)定期OD大，代時短緣由：轉速影響溶氧，溶氧高，生

20、長情況應該越好實際：大腸桿菌與預期符合；枯草桿菌轉速快的調整期長，代時長。分析：緣由可能有兩點，一是枯草桿菌在溶氧高的環(huán)境下生長沒有那么好，說明它是微好氧生物，但這與實際不符；二是其他條件限制，雖然說兩個培育瓶進行對比要求其他條件全都，但是由于培育基安排及其其他各種緣由，其他條件可能并不全都而且還產生了比對比條件還要大的影響。4） 生長曲線分析兩個菌的生長曲線都包括了調整期、對數期和穩(wěn)定期，實驗沒有進行到衰亡期由于而沒有觀察到后來的OD值下降。5） 大腸桿菌和枯草桿菌比較大腸桿菌：代時要短一些，溫度對代時的影響比溶氧對代時的影響要大，估量是由于溶液中細胞不多，所以溶氧的限制作用沒有溫度明顯?？?/p>

21、草桿菌：代時較長，溶氧比溫度對代時的影響要大，但這也可能是實驗操作中其他因素影響而得出的表觀結果。六、 實驗小結這是一個大組合作、小組分工的實驗，每一組的結果都影響了整個大組隊結果的分析，這就要求我們的合作。和暑期實驗不同，這次實驗在時間上縮短了，但是在內容上卻增多了，由于有很多組的平行比較，所以得到的信息量也相應加大，這些信息中又包含了這種各樣的誤差，所以要求我們自己在處理別人的實驗結果中也加入自己的分析。總的來說，這是個很有意思也很有意義的實驗。七、 思考1. 計算出大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨葡萄糖培育基中對數生長期中的代時(min)（繁殖一代的時間），為什么比理論時間長好多？代

22、時見表二。經查資料得：大腸桿菌理論代時為37度時18分鐘，而枯草桿菌一般是給30度下的理論代時為31分鐘，實驗測得代時長于理論值的緣由： 理論代時是在抱負的培育條件下測得，糖分、氧氣等營養(yǎng)物質供應充足，細菌生長狀況良好，之前的分裂次數較少。實際實驗條件與理論值條件存在差距。如培育過程中不補料，營養(yǎng)物質有限。單純的振蕩不能保證體系中有足夠的溶氧。對培育液的pH值，氧化還原電勢也未加掌握，測量過程中溫度不能保持穩(wěn)定等等。2. 為什么可用比濁法來表示細菌的相對生長狀況？培育液的渾濁度與細菌的濃度與成正比，可以利用分光光度計測定細菌濁液的光密度來推知菌液的濃度。濁度的變化代表體系細菌數量的變化。其原理是：一個細胞懸浮液用肉眼觀察是呈現混濁的，這是由于光線通過懸浮液是，細胞散射光線。存在的細胞數越多，分散的光線就越多，因此懸浮液濁度就越大。通過分光光度計可以檢出沒有被細胞散射的光線。對于大腸桿菌和枯草桿菌，從理論上OD值與細胞總量成正比?？梢灾苽鋵⒓毎麛的颗c濁度聯(lián)系起來的標準曲線。3. 生長曲線中為什么會有穩(wěn)定期和衰退期？當細胞的繁