1、【摘要】 肝癌（hepatocellular carcinoma, hcc）為我國常見惡性腫瘤之一。體內的動物實驗以及未經 治療 的hcc均存在細胞凋亡現(xiàn)象。 細胞凋亡是一個簡單的 網絡 系統(tǒng), 受多系統(tǒng)、多水平、多因素共同調控。誘導其細胞凋亡的各種 方法 在 理論 上來說就可以治療肝癌。本文綜合論述了有關參加肝癌細胞凋亡的一些因素如p53, bcl-2, survivin，caspase，trail， cox-2在調整細胞增殖與細胞凋亡平衡中的相互作用， 以及某些抗腫瘤治療的可能機制?！娟P鍵詞】 細胞凋亡; p53; survivin; caspase; trail; cox-2肝癌（hep

2、atocellularcarcinoma, hcc）有原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌之分， 原發(fā)性肝癌為我國常見惡性腫瘤之一。體外培育的肝癌細胞, 體內的動物實驗以及未經治療的hcc均存在細胞凋亡現(xiàn)象, 凋亡指數(shù)的凹凸直接關系到肝癌患者的預后。細胞凋亡是機體清除年輕、異常細胞, 維持內環(huán)境穩(wěn)定的重要生理功能。免疫應答、造血系統(tǒng)的調控、胚胎的發(fā)育、腫瘤的形成都與細胞凋亡息息相關。腫瘤的發(fā)生、 進展 與正常的細胞凋亡過程被抑制， 破壞了細胞增殖與凋亡之間的平衡有肯定關系。 現(xiàn)在廣泛認為細胞凋亡是一個簡單的網絡系統(tǒng), 受多系統(tǒng)、多水平、多因素、多基因共同調控。誘導其細胞凋亡的各種方法在理論上來說就可以治療肝

3、癌。本文簡潔介紹有關參加肝癌細胞凋亡的一些特異性（p53，fas，bcl-2/bax基因等）和非特異性信號分子以及其他因素在調整細胞增殖與細胞凋亡平衡中的相互作用， 以及某些抗腫瘤治療的可能機制。1. 肝癌細胞凋亡通路的基因調控細胞凋亡是一個多基因調控的簡單過程， 主要是由誘導基因、 抑制基因和雙向掌握基因相互作用的結果。調控肝癌細胞凋亡的基因分為兩大類, 一類是抑制肝癌細胞凋亡的基因, 主要有bcl-2和生存素（survivin）；另一類是促進肝癌細胞凋亡的誘導基因, 有p53、fas/fasl、trail等。通過這些基因的表達和相互作用, 對肝癌細胞凋亡的調控起著重要的作用。11 p53基

4、因 p53基因是 目前 為止發(fā)現(xiàn)的最重要的抑癌基因, p53全長20kb, 位于人染色體17q13.1,由11個外顯子構成, 是細胞生長周期中的負調控因子, 對細胞周期的調控、dna的修復、細胞分化、細胞凋亡等有重要生物學作用。幾乎全部的腫瘤都存在p53的突變, p53的突變不只是引起野生型p53蛋白的失活, 還可能產生功能不同的突變p53蛋白。突變的p53具有促進細胞轉化, 引起腫瘤細胞的大量增殖,抑制細胞的凋亡。據(jù)統(tǒng)計p53在hcc中的突變率在（69.37±18.81）%, 分化越差, 突變率越高3, 由此產生的大量突變p53蛋白將 影響 下游基因的調控, 如bcl-2、bax等

5、。12 fas基因 fas/fasl系統(tǒng)是機體重要的細胞凋亡系統(tǒng),它包括fas、fasl 及它們的可溶性形式sfas、sfasl。fas蛋白為型跨膜蛋白,屬于腫瘤壞死因子家族,分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)。胞外區(qū)的n端有一個約含80個氨基酸的死亡域, 與凋亡信號傳導有關。fas主要以膜受體形式存在, 可通過轉錄水平的不同剪接產生多種可溶性fas分子（sfas）, 它與fas較相像, 但缺少跨膜結構域, 與fasl結合后可對fas介導的細胞凋亡起重要的負調節(jié)作用。一般認為導致肝癌細胞凋亡是由于fas受體的激活和之后的caspase-8的激活， 或者通過fasl的上調9,10。部分抗肝癌藥物（如干擾

6、素）即是通過該途徑11。fas在hcc中表達明顯削減, 甚至完全丟失,而且fas的表達與hcc的分化程度有關,分化程度愈低, fas表達愈少。多數(shù)hcc 對fas/fasl介導的細胞凋亡耐受,可能是hcc 上的fas表達較少, 或者sfas競爭性地與fasl結合, 阻斷了fas/fasl介導的細胞凋亡。有報道hcc表達高水平的fas和fasl在同一個區(qū)域, 且對fas/fasl介導的細胞凋亡耐受12, 認為可能是hcc上的fasl與抗腫瘤淋巴細胞fas結合, 引起淋巴細胞的死亡, 逃脫免疫監(jiān)視；fas介導的細胞凋亡受多種蛋白及酶類影響, 如腫瘤細胞上的fas相關磷酸脂酶-1、flip（flic

7、e/caspase-8inhibitoryprotein）可與fas受體結合, 抑制fas介導的信號傳導。bcl-2、p53以及一些癌基因對fas也具有重要的調節(jié)作用13。bcl-2在急性肝炎的膽管中存在，在肝癌中失表達。其高表達可導致肝癌細胞對多種促凋亡因素如藥物、射線及cytokin等耐藥，而誘導劑（天花粉、氧化砷）通過下調腫瘤細胞bcl-2的表達誘導肝癌細胞的凋亡。bax高表達能增強由adriamycin誘導的 hcc-9204細胞的凋亡，增強細胞對凋亡的敏感性18。14 survivin基因 survivin是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis pro

8、tein, iap）的新成員，與其他iap成員不同，結構獨特，只含有一個桿狀病毒iap重復序列（baculovirus iap repeat）和非鋅指結構，survivin位于人染色體17q25,含有4個外顯子和3個內含子,相對分子質量為25×10319。商量發(fā)現(xiàn)survivin 在肝癌中具有選擇性表達的特性，這一特性為其在原發(fā)性肝癌中治療靶點作用供應了理論依據(jù)。survivin與凋亡抑制呈正相關，與預后親密相關。 ikeguchi等20對57例hcc檢測發(fā)現(xiàn),41%的肝癌組織有survivin mrna的表達,其表達與年齡、性別、腫瘤大小無關,在正常肝組織中沒有檢測到,surviv

9、in表達陽性的肝癌組織的凋亡指數(shù)顯著低于survivin表達陰性的肝癌組織。但是目前對survivin的功能尚存爭議。一些商量顯示, survivin對細胞凋亡以及增殖并無明顯影響。另外一些商量則顯示，survivin具有抑制凋亡和調節(jié)細胞分裂的雙重功能,有助于多種腫瘤細胞低預各種凋亡刺激。survivin抑制凋亡的機制是通過bir功能區(qū)直接影響凋亡信號傳導通路的終末效應分子caspase-3或caspase-7的活化,從而抑制多種上游信號所誘導的凋亡, 也發(fā)現(xiàn)survivin抑制細胞色素c從線粒體釋放, 阻斷上游信號分子caspase-9的活化,從而阻斷細胞凋亡信號的傳導 19,27。gao

10、yan等21設計一對survivin-sirna,體外轉錄制備sirna, 觀察了 應用 rnai技術靶向封閉survivin基因對肝癌細胞株hepg2增殖和凋亡的影響, 細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)細胞凋亡率并無變化。而王穎等22發(fā)現(xiàn)不同濃度 survivin sirna 轉染能下調survivin 蛋白和 mrna 表達，誘導肝癌細胞凋亡，抑制細胞增殖，增加肝癌細胞對化療藥物的敏感性,提示接受基因技術封閉 survivin 蛋白表達，可以解除 survivin 對凋亡的抑制作用，誘導腫瘤細胞凋亡，從而達到治療的目的。另外據(jù) 文獻 報道, survivin反義核酸能夠明顯誘導腫瘤細胞凋亡和抑制增值，是腫

11、瘤反義期治療的較抱負的靶基因。chen等23發(fā)現(xiàn), 在smmc-7721 細胞中caspase-3的活性水平極低。這有利于肝癌細胞躲避凋亡,維持較高的增殖活性。而在survivin asodn 轉染后, caspase-3 活性水平呈劑量依靠性上升, 說明在smmc-7721 細胞中caspase-3 的低活性狀態(tài)可能是由于survivin 表達所致；以asodn 封閉survivin基因表達導致的caspase-3活化, 是其誘導肝癌細胞凋亡過程中的關鍵環(huán)節(jié)。cheng等24發(fā)現(xiàn)rnai能降低smmc-7721 細胞中survivin基因表達，從而誘導細胞凋亡和抑制腫瘤細胞的生長。盡管sur

12、vivin對細胞凋亡以及增殖的影響目前還存在爭議，已有結果顯示survivin機制的商量有助于對肝癌細胞凋亡的生疏，為抗癌治療供應有效靶點有著重要的意義。2. 調控肝癌細胞凋亡的其他因素除基因外，很多酶、信號分子等參加凋亡的啟動和調節(jié)，如caspase家族，tgf/tgf受體, tnf家族, cox-2等，調整著細胞增殖與凋亡的平衡。2.1. 半胱天冬酶（caspase）家族 細胞凋亡的核心成分是半胱氨酸蛋白酶家族，凋亡可能就是蛋白酶級聯(lián)切割的過程。其中商量最多，功能相對較明確的為caspase-3, 是哺乳動物細胞凋亡的關鍵蛋白酶之一，為凋亡的效應分子，被稱為凋亡的“執(zhí)行者”25。經典的細胞

13、凋亡途徑有兩條，分別是細胞外途徑（細胞表面死亡受體途徑）和細胞內途徑（線粒體引發(fā)途徑）。在細胞外途徑中，死亡信號的傳導依靠于死亡配體與受體（如tnf-和tnfr, fasl和fas）的結合，接著死亡受體的死亡結構域（dd）與信號傳導分子（如fadd）結合，而fadd又可與caspase-8酶原的ded相連接，形成死亡誘導信號復合物（disc），隨之caspase-8被激活，它通過裂解bid使線粒體釋放細胞色素c，或直接作用caspase-3及其他下游的caspase。有商量顯示激活的caspase-3可裂解相應的胞核內底物dna修復酶（poly adp-ribose polymerase， p

14、arp），使parp失去對dna的修復功能，導致細胞轉向凋亡 26。商量發(fā)現(xiàn)在fas介導肝癌細胞系凋亡過程中，caspase-3活性增高，使用caspase-3抑制劑devdcho能顯著抑制caspase-3的活化，藉此抑制fas介導的細胞凋亡。而ice抑制劑yvadcho則不能抑制fas介導的細胞凋亡。提示在fas介導的人肝癌細胞系凋亡過程中，主要起作用的是caspase-3，而不是icea。于合成紫花茄皂貳誘導人肝癌細胞株bcl-7402凋亡的體外實驗中發(fā)現(xiàn)，紫花茄皂貳通過上調細胞內細胞色素c的表達水平而激活caspase-3，從而導致細胞凋亡17。nk-104是日本新近研制的第三代hmg

15、-coa還原酶抑制劑，商量結果表明10 mol/l nk-104能夠增強caspase-3的活性，加入mev能夠消除nk-104的這種誘導作用 27。caspase可被多種物質激活，一般認為化療藥物以及高滲引起細胞凋亡大多通過激活caspase-3起作用28。 低濃度的谷胱甘肽-阿霉素（gsh-dxr）比dxr更有效地引起鼠肝細胞（ah66）的凋亡，并能提高caspase-3大約100倍。兩種藥物處理12和15h后可見caspase-3的活性增加和dna的斷裂29?？梢姷蛲銮案鞣N強信號激活caspase-3是凋亡突增的必經途徑。在細胞內途徑中，細胞內的死亡信號，如dna損傷、毒素、bax、癌基

16、因抑制劑、紫外照耀和atp耗竭等均可誘發(fā)線粒體釋放細胞色素c（ cyt c）到胞質，隨即 atp 依靠性激活凋亡蛋白水解酶活化因子-1（apoptotic protease-activating factor1，apaf-1）。 在這一途徑中， cyt c 的釋放是該調節(jié)通路中的關鍵大事，它可導致由 cyt c，apaf-1 和 procaspase-9 構成的“凋亡體”（apoptosome）形成，從而激活 caspase-9。 活化的caspase-9 從“凋亡體”中釋放出來，進而引發(fā) caspase級聯(lián)放大反應，最終導致細胞凋亡。以往商量中已證實氟尿嘧啶可誘導肝癌細胞凋亡，并有外源性通路

17、上的相關基因參加調控。最近商量顯示在氟尿嘧啶誘導肝癌細胞凋亡過程中caspase-9 被活化，活性明顯增強，caspase-9 抑制劑可阻斷這一過程。表明 caspase-9參加了氟尿嘧啶誘導的肝癌細胞凋亡30。 cyt c 由核基因編碼，在核糖體中合成前體物阿樸細胞色素 c（apocytochrome c）后轉運入線粒體。 diekert 等31發(fā)現(xiàn)，在apocytochrome c 轉運進入線粒體時需要 tom 復合體，并認為 tom 復合體是包括 apocytochrome c 在內的細胞凋亡相關蛋白進入線粒體的共同通路。在三氧化二砷（as2o3）誘導肝癌細胞凋亡的基因 分析 中顯示線粒

18、體外膜受體tom20基因表達上調。綜上所述，caspase-3、 caspase-9 的活化被認為是細胞凋亡機制中的重要環(huán)節(jié)。目前的關鍵 問題 是caspase-3、 caspase-9等在多種因素誘導的肝癌細胞凋亡中是否起獨立作用，其表達與腫瘤細胞的凋亡是否存在必定關系，另外，其激活機制及聯(lián)系尚未清晰，有待于我們進一步的深化商量。2.2. 壞死因子相關凋亡誘導配體（tumornecrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand, trail）trail是腫瘤壞死因子（tumornecrosisfamily, tnf）家族成員, 可與tnf受體超家族

19、成員類似的胞漿死亡結構域結合, 通過死亡結構域激發(fā)和傳導死亡信號, 激活caspase蛋白酶級聯(lián)反應, 導致細胞凋亡。trail的一個顯著特點就是能在各種轉化細胞中選擇性導致凋亡，但在正常組織中卻無此作用。在對肝癌的商量中發(fā)現(xiàn), 盡管大部分的人類腫瘤對trail誘導的凋亡敏感, 但hcc對trail誘導的細胞凋亡明顯耐受32。trail可以誘導nf-b表達的增高, 后者可抗細胞的凋亡。有學者用特異性的nf-b抑制劑sn50 作用于trail 誘導的hcc細胞凋亡, 發(fā)現(xiàn)該抑制劑對trail誘導的細胞凋亡沒有多大影響, 表明trail誘導的nf-b活性上升與trail對hcc誘導的細胞凋亡耐受并不相關聯(lián)。 認為hcc對trail誘導的細胞凋亡耐受可能是腫瘤細胞內存在凋亡抑制劑, 如cfilp（caspase8/fliceinhibitory protein, cfilp）、bcl-xl、bax、bid等33。 也有商量發(fā)現(xiàn)經trail處理后，肝癌細胞消失了凋亡的同時bcl-2, bcl-xl抗凋亡蛋白的表達均呈上升趨勢，而促凋亡蛋白bax的表達卻呈現(xiàn)出下降的趨勢。深化商量發(fā)現(xiàn)經trail處理后細胞的nf