1、時間分辨熒光免疫分析實驗操作指南以及注意事項第一節(jié)時間分辨反應過程圖TRFIA的操作要點優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證TRFIA檢測結果準確可靠的必要條件。下面列出TRFIA各個操作步驟的注意要點，嚴格遵照規(guī)定操作.1、樣本的采取和保存TRFIA測定的樣本一般為血清。不能使用含抗凝劑EDTAF口檸檬酸的樣本，因為二者可以螯合筠，使測定值降低。血清樣本可按常規(guī)方法采集，溶血和脂血樣本可能會影響測值。樣品在2C-8c可以保存3-5天,如果需要長期保存，請20c保存，避免反復凍融。凍結血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，宜輕緩充分混勻，避免氣泡，可上下顛倒混和。不要把樣本保存在室溫，室溫

2、放置48小時可能會導致結果不穩(wěn)定。2、試劑的準備整個實驗過程應盡量在干凈無塵的環(huán)境下進行實驗前應檢查試劑盒的出廠日期以確定試劑盒是否過期，一般自產(chǎn)品檢驗合格出廠日期起有效期為一年。按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。TRFIA中用的去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質(zhì)量的去離子水。從冰箱中取出的試驗用試劑應待其溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。試劑盒中的標準品或銪標試劑若是凍干的狀態(tài)，第一次開盒做實驗在加去離子水溶解標準品或銪標后，請不要立刻開始使用，靜置10分鐘左右待其溶解完全后再開始。板條若未能一次用完，剩余板條用塑料袋（內(nèi)有干燥劑）封口后密

3、封保存。TRFIA受反應溫度的不恒定、操作誤差以及鉆標記物的穩(wěn)定性等因素的影響，不同日期的熒光值會有所波動，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線。3、加樣在TRFIA中一般有3次加樣步驟，即加樣本，加銪標記物，加增強液。加樣時應將所加物加在微孔板的底部，避免加在孔壁上部，不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加樣本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。加不同的樣本應更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染。加銪標記和增強液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。連續(xù)加樣器使用時要連續(xù)流暢，并不是加樣越慢越好！加樣時檢測吸嘴是否堵塞，加量是否足夠，注意吸頭之間是有差異的。

4、加樣品時把樣品按12個一排排好，做時每加樣一個，就把它前移一排，這樣不容易出錯。注意按操作步驟計算試劑的量是否充足，特別是使用全自動儀器時！使用干凈的一次性容器配制銪標記物。銪標記物的污染是造成實驗本底增高的首要原因。注意銪標記物的瓶蓋不要與標準品瓶蓋混用；所有接觸過銪標記物的用品使用完畢應該丟棄，不能重復使用。注意銪標記物原液和工作不要污染實驗臺面、加樣槍及試劑盒中的其他組份。4、孵育在TRFIA中一般有一次或兩次抗原抗體反應，即加樣本和銪標記物后?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為孵育，或者溫育。目前TRFIA常用模式在微孔板中進行，屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合

5、只在周相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的樣本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗體結合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應的終點。在其后加入的鉆標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么TRFIA反應總是需要一定時間的孵育。孵育在室溫進行即可。室溫一般指20-25Co室內(nèi)溫度白高低會影響TRFIA的熒光值，升高，抗原抗體反應加速，熒光值提高。反之，則降低。全自動儀器，孵育過程在一個恒溫（25）的孵育器內(nèi)完成，熒光值比較恒定。如果使用半自動儀器，孵育過程需要加蓋封片，防止污染和液體的揮發(fā)。TRFIA房孵育過

6、程一般在振蕩器上完成，注意調(diào)節(jié)振蕩的幅度和頻率。振蕩的幅度太大、頻率太高，微孔板內(nèi)液體可能溢出，影響實驗結果；振蕩的幅度太小、頻率太低，抗原抗體反應不完全，也可能影響實驗的結果。振蕩器上的微孔反應板不宜疊加堆放。疊加可能造成反應板的灑落，同時可能造成反應的不均勻。孵育的溫度和時間應嚴格遵照說明書規(guī)定。不同的檢測項目，待測物質(zhì)的性質(zhì)不同，反應的時間是有差別的。5、洗滌洗滌在TRFIA不是一個反應步驟，卻也決定著實驗的成敗。TRFIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的銪標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。在TR

7、FIA操作中，洗滌是最比較的關鍵技術，操作者應嚴格按要求進行。TRFIA的洗滌方式一般使用自動洗板機，不需手工操作。洗板機在每天使用時應進行校正注液量和殘留量，注意管道是否通暢。洗滌時，確認每孔中的洗滌液都注滿微孔，洗滌后，需將板倒扣在無塵吸水紙上拍干，拍干完畢，將反應板對光檢查，孔底內(nèi)外側(cè)均必須無殘留液體。注意微孔反應板的底部不要弄臟或劃傷，不要用手摸微孔反應板的底部。6、加增強液TRFIA技術特點之一就是抗原抗體反應完畢，加增強液，使得熒光信號增強100萬倍，檢測靈敏度大大提高。加增強液時，最好能每次吸取增強液都更換槍頭，如果不更換槍頭，加增強液時應懸空加入，千萬不要讓吸頭碰到小孔邊緣或其

8、中試劑而造成增強液污染。增強液的體積數(shù)應嚴格按說明書的要求；加完后增強液不能灑出；一旦灑出，此次實驗無效，需要重做。第二節(jié)時間分辨試劑盒的組成包括：包被反應板：一塊，96孔。銪標記抗抗體：一瓶，凍干品，用時每瓶以1ml去離子水溶解緩沖液參考標準品：共六瓶。增強液：一瓶，50ml。濃縮洗液25:一瓶，50ml,使用前用去離子水作1:25稀釋。分析緩沖液：一瓶，50ml。說明書：一份。第三節(jié)時間分辨操作基本步驟Eu3+（1）雙抗體夾心法（檢測抗原）：一抗包被、封閉一加入檢測樣品一加入標記的二抗一加入增強液一檢測JrisiAFP lii sample k + : Solid pbasc： anii-

9、AFP例如：TRFIA法檢測甲胎蛋白（AFP）實驗方法1.試劑的準備1ml1)甲胎蛋白參考標準品：使用前一小時將每瓶甲胎蛋白參考標準品用去離子水溶解。2)洗滌液：將50ml濃縮洗液和1200ml去離子水混合，作為工作洗滌液。3) 銪標抗體工作液：使用前一小時將每瓶銪標記抗甲胎蛋白抗體用1ml去離子水溶解，用分析緩沖液以1:75倍稀釋作為銪標抗體工作液。2 .將所需數(shù)量的包被反應條置室溫平衡。3 .每孔加25l甲胎蛋白參考標準品或樣品。a、 選一支最接近25l的加樣器，因為參考標準品是實驗最關鍵的第一步，所以加樣量要求非常準確。b、 在吸參考標準品時槍要在液體內(nèi)吹打4次，使槍頭內(nèi)的表面張力平衡，

10、從而達到吸樣時進一步減少誤差。c、將樣品加入到反應孔中要注意槍要垂直輕輕靠在孔壁上打入樣品，要保持一個樣品一只槍頭，這樣可以避免加樣污染和孔內(nèi)包被物不受加樣影響。4 .加200l分析緩沖液，振動孵育1小時。a、 剪一張與加樣條大小相似的封口膜平穩(wěn)封上加板條，寫上標記。b、 將樣品板放入震蕩器時注意，減速、平穩(wěn)、輕巧、放入震蕩器中。5 .用洗滌液沖洗4次。a、洗板時要注意板一定要與洗板機的樣品架吻合6 .每孔加鉆標抗體工作液2001,振動孵育1小時。a、筠標是是實驗最關鍵的第二個步驟，所以配箱標時一定要保證，比例準確、充分混勻、加樣量準確。7 .用洗滌液沖洗6次。a、洗板時要注意板一定要與洗板機

11、的樣品架吻合8 .每孔加增強液2001,振蕩孵育5分鐘a、增強液是實驗最關鍵的第三個步驟，雖然增強液是一個不要做任何處理就可以直接使用，但它是一個最形容污染的液體，所以加增強液時一定要注意，加增強液槍頭不能碰樣品孔、吸增強液手法要輕柔避免液體反壓力過大回流到加樣器內(nèi)。9 .測定。夾心法，濃度與熒光值成正比。雙抗體夾心法標準曲線圖1（LOGLOGB擬合方式）（2）競爭法（檢測抗體）：例如：TRFIA法檢測總?cè)饧谞钕僭彼幔═T3）實驗方法抗原包被、封閉-加入一抗/檢測樣品-加入Eu3而記的二抗f加入增強液檢測1. 試劑的準備1） 總?cè)饧谞钕僭彼釁⒖紭藴势罚菏褂们耙恍r將每瓶總?cè)饧谞钕僭?/p>

12、酸參考標準品用1ml去離子水溶解。2）洗滌液：將50ml濃縮洗液和1200ml去離子水混合，作為工作洗滌液。3） 銪標抗體工作液：使用前一小時將每瓶銪標記抗總?cè)饧谞钕僭彼峥贵w用1ml去離子水溶解，用分析緩沖液以1:50倍稀釋作為銪標抗體工作液。2. 將所需數(shù)量的包被反應條置室溫平衡。3 .吸取50屋參考標準品或待測樣品，按順序加入微孔反應條小孔中，然后各加100屋箱標記三碘甲狀腺原氨酸工作液和100屋抗三碘甲狀腺原氨酸抗體工作液。a、選一支最接近501和1001的加樣器，因為參考標準品是實驗最關鍵的第一步，所以加樣量要求非常準確。b、在吸參考標準品時槍要在液體內(nèi)吹打4次，使槍頭內(nèi)的表面張力平衡，從而達到吸樣時進一步減少誤差。c、將樣品加入到反應孔中要注意槍要垂直輕輕靠在孔壁上打入樣品，要保持一個樣品一只槍頭，這樣可以避免加樣污染和孔內(nèi)包被物不受加樣影響。4 .室溫振動孵育1.5小時a、剪一張與加樣條大小相似的封口膜平穩(wěn)封上加板條，寫上標記。b、將樣品板放入震蕩器時注意，減速、平穩(wěn)、輕巧、放入震蕩器中5用洗滌液沖洗6次，拍干。a、洗板時要注意板一定要與洗板機的樣品架吻合。6 .每孔加增強液200仙1,振蕩孵育5分鐘。a、增強液是實驗最關鍵的第二步，雖然增強液是一個不要做任何處理就可以直接使用，但它是一個最形容污染的液體，所以加增強液時一定要