1、WORD格式免疫組化操作方法、原理、步驟以及常見問題處理大總結(jié)1 、方法操作不難，最大的難處是出現(xiàn)異常結(jié)果時(shí)如何解決？這就需要掌握免疫組化實(shí)驗(yàn)原理， 每一步知道為什么這樣做，這樣你才敢大膽地改革先前的不對的方法步驟。如抗體孵育條件主要是抗體濃度、溫度、時(shí)間，這三者一般是相互成反比的相對，其中濃度是最重要的先決條件，溫度決定反響的速度、時(shí)間決定反響的量。就拿溫度來說，可以有4度、室溫、 37 度，我推薦4 度最正確，反響最溫和，背景較淺；而37 度反響速度較快，時(shí)間較短； 室溫我不太提倡，除非你每次都把環(huán)境溫度控制在一定的X圍，否那么，盡量選擇前兩者。2、免疫組化最大的優(yōu)勢是定位和定性。 相比于

2、其他蛋白檢測方法，免疫組化具有定性靈敏度高、 定位較直接準(zhǔn)確， 是定位檢測分析首選方法。 尤其對于有些因子的轉(zhuǎn)位研究十分有用。3、免疫組化結(jié)果定量分析的前提是高質(zhì)量的染色切片。免疫組化結(jié)果也能定量分析，但必須是背景染色淺而特異性染色較深的情況下，分析最為準(zhǔn)確， 這種原那么可能也是我們?nèi)粘徃鍟r(shí)判定研究結(jié)果的必備條件。4、免疫組化實(shí)驗(yàn)一定要設(shè)置陽性對照和陰性對照。陽性對照一般是用肯定表達(dá)這種抗原的切片來做； 陰性對照一般是用PBS或非一抗替代一抗來進(jìn)展反響，其余步驟均一致。前者是排除方法和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有無問題；后者是排除有無一抗外的非特異性染色。5、免疫組化的應(yīng)用廣泛，是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)研究的最重要方法之一

3、。如今發(fā) SCI 論文時(shí)，明顯感覺僅靠量化的數(shù)據(jù)來發(fā)文章很難，加一些形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)或圖片，老外十分歡迎， 可能是怕你學(xué)術(shù)造假吧。當(dāng)然也不能做假陽性或假陰性結(jié)果。6、免疫組化技術(shù)掌握與否的鑒定標(biāo)準(zhǔn)是同一切片或不同切片中不同抗原均從摸索濃度或條件而做出優(yōu)良的染色切片。我在平時(shí)帶教中就發(fā)現(xiàn)許多研究生把我已經(jīng)摸索很成熟的反響條件、濃度、方法步驟， 重復(fù)運(yùn)用于同一性質(zhì)的切片和同一種抗體，做出來后就覺得自己已經(jīng)掌握了免疫組化方法，更換一種抗體后，居然連二抗的種屬來源都拿錯(cuò)了。失敗往往促進(jìn)你去思考試驗(yàn)原理和過程，成功有時(shí)也加快你自傲。7、實(shí)驗(yàn)方法需要?jiǎng)邮?動(dòng)腦。如今我還不敢說我在免疫組化什么都知道。我只所以今天

4、敢在這里說這說那，這是因?yàn)槲医?jīng)過了反復(fù)的動(dòng)手+動(dòng)腦，把理論原理運(yùn)用于實(shí)踐，在把實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)的問題帶到理論知識中去解決，最終把理論與實(shí)踐融會(huì)貫穿。一、概念和常用方法介紹1、定義 用標(biāo)記的特異性抗體對組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量進(jìn)展組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)（ immunohistochemistry 技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué) immunocytochemistry 技術(shù)。2、原理 根據(jù)抗原抗體反響和化學(xué)顯色原理，組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原先和一抗結(jié)合， 再利用一抗與標(biāo)記生物素、 熒光素等的二抗進(jìn)展反響， 前者再用標(biāo)記辣根過氧化物酶 HRP或堿性磷酸酶 A

5、KP等的抗生物素如鏈霉親和素等結(jié)合，最后通過呈色反響或熒光來顯示細(xì)胞或組織中化學(xué)成分， 在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反響產(chǎn)物， 從而能夠在細(xì)胞爬片或組織切片上原位確定某些化學(xué)成分的分布和含量。專業(yè)資料整理WORD格式3、分類1 按標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶主要有辣根專業(yè)資料整理WORD格式過氧化物酶和堿性磷酸酶、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標(biāo)法和免疫金銀法等。2按染色步驟可分為直接法又稱一步法和間接法二步、三步或多步法。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。3按結(jié)合方式可分為抗原-抗體結(jié)合，如過氧化物酶- 抗過氧化物酶P

6、AP法；親和連接，如卵白素- 生物素 - 過氧化物酶復(fù)合物 ABC法、鏈霉菌抗生物素蛋白- 過氧化物酶連結(jié)SP法等，其中SP法是比較專業(yè)資料整理WORD格式常用的方法； 聚合物， 如即用型二步法， 此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織抗原檢測。4、目前幾種常用免疫組化方法簡單介紹1 免疫熒光方法是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。 它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會(huì)發(fā)出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)展定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、

7、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中應(yīng)用較廣。2免疫酶標(biāo)方法免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于 60 年代開展起來的技術(shù)。根本原理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后參加酶的底物， 生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒， 通過光鏡或電鏡， 對細(xì)胞外表和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)展定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前最常用的技術(shù)。本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點(diǎn)是：定位準(zhǔn)確， 對比度好，染色標(biāo)本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。免疫酶標(biāo)方法的開展非常迅速，已經(jīng)衍生出了多種標(biāo)記方法，且隨著方法的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來越方便。目前在病理診斷中廣為使用的有ABC法、 S

8、P 三步法、即用型二步法檢測系統(tǒng)等。3免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對蛋白的生物學(xué)活性那么沒有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、 二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子( 如葡萄球菌 A 蛋白 )等作為探針，就能對組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)展定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒， 且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。 由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進(jìn)展光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法那么更便于光鏡觀察。5、被檢測的物質(zhì)組織或細(xì)胞中但凡能

9、作為抗原或半抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)展檢測。6、特點(diǎn)1 特異性強(qiáng)。免疫學(xué)的根本原理決定抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此， 免疫組化從理論上講也是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示，如角蛋白 keratin顯示上皮成分， LCA顯示淋巴細(xì)胞成分。只有當(dāng)組織細(xì)胞中存在穿插抗原時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)穿插反響。 2敏感性高。在應(yīng)用免疫組化的起始階段，由于技術(shù)上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術(shù)，那時(shí)的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現(xiàn)在由于ABC法或 SP三步法的出現(xiàn)， 使抗體稀釋上千倍、 上萬倍甚至上億倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合，這樣

10、高敏感性的抗體抗原反響， 使免疫組化方法越來越方便地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷工作。3定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合。 該技術(shù)通過抗原抗體反響及呈色反響，可在組織和細(xì)胞中進(jìn)展抗原的準(zhǔn)確定位， 因而可同時(shí)對不同抗原在同一組織或細(xì)胞中進(jìn)展定位觀察，這樣就可以進(jìn)展形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對病理學(xué)領(lǐng)域開展深入研究是十分有意義的。7、從蛋白水平檢測角度，免疫組化技術(shù)與Western blotting、ELISA 的異同 1Western blotting：蛋白質(zhì)免疫印跡，也是利用抗體抗原反響原理，結(jié)合化學(xué)發(fā)光等技術(shù)來檢查組織或細(xì)胞樣品內(nèi)蛋白含量的檢測方法。與免疫組化技術(shù)相比，定量可能更加準(zhǔn)確；當(dāng)然 Western

11、blotting也可定性和定位通過提取膜蛋白或核蛋白、胞漿蛋白分別檢測其中抗原含量，進(jìn)而間接反映它們的定位，但敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于免疫組化技術(shù)。2ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)， 也是利用抗體 - 抗原 - 抗原結(jié)合反響原理來檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的檢測。與免疫組化技術(shù)相比，定量最準(zhǔn)確，是分泌性蛋白檢測首選方法之一。二、實(shí)驗(yàn)流程簡介專業(yè)資料整理WORD格式1、 SP三步法1石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。2 0.3%或 3%H2O2去離子水無色液體孵育10-30 分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。 3蒸餾水沖洗， PBS浸泡 5 分鐘 4候選步驟：采用抗原修復(fù)：微波建議 30 分鐘內(nèi) 4 次中火、高壓、

12、酶修復(fù)方法。自然冷卻，再用3 分鐘× 3 次 . 5血清封閉：室溫 15-30 分鐘，盡可能與二抗來源一致。傾去，勿洗。 6滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37孵育 23 小時(shí)或 4過夜最好復(fù)溫。PBS沖洗， 3 分鐘× 5 次。 7滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫或37孵育 30 分鐘 -1h 。 8 PBS沖洗， 3 分鐘× 5 次。 9滴加 SP鏈霉親和素-過氧化物酶，室溫或37孵育 30 分鐘 -1h 。 10 PBS沖洗， 3 分鐘× 5 次。 11顯色劑顯色 DAB等。 12自來水充分沖洗。13可進(jìn)展復(fù)染，脫水，透明。14選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?、即用型二

13、步法1 脫蠟、水化組織切片。2根據(jù)所應(yīng)用的一抗的特殊要求，對組織切片進(jìn)展預(yù)處理。3 0.3%或 3%H2O2去離子水孵育5 分鐘 -30 分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶， PBS或 TBS沖洗。 4滴加一抗，室溫或37孵育 3060 分鐘，或4過夜， PBS或 TBS浸洗 3 分鐘× 5 次。 5滴加 enhangcer 增強(qiáng)劑， 37 度 30min，PBS或 TBS浸洗 3 分鐘×5 次。 6滴加通用型 IgG 抗體 -Fab 段 -HRP多聚體，室溫 /37 孵育 30 分鐘 -1h ，PBS/TBS沖洗， 3 分鐘× 5 次。 7應(yīng)用 DAB溶液顯色。 8蒸

14、餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。三、免疫熒光技術(shù)1、免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)1 冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否那么組織細(xì)胞內(nèi)部構(gòu)造破壞， 易使抗原彌散。 選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴(yán)重。 2組織切片固定： 切好片風(fēng)干后立即用冰西奈山環(huán)保組織固定液固定5-10min ，尤其要較長時(shí)間保存的白片，一定要及時(shí)固定和適當(dāng)保存。3血清封閉：為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清與二抗來源一致 封閉，減弱背景著色。血清封閉的時(shí)間是可以調(diào)整的，一般10-30min 。4一抗孵育條件：在免疫組化反響中最重要，包括孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4

15、 度、室溫、 37 度，其中 4 度效果最正確；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37 度 1-2h ，而 4 度過夜和從冰箱拿出后 37 度復(fù)溫 45min 。具體條件還要摸索。5二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度 30min-1h ，具體時(shí)間需要摸索，而濃度一般有工作液，假設(shè)是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反響。 但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。 最后，熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時(shí)間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時(shí)小包裝和并進(jìn)展適當(dāng)?shù)碾x心。6復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對目標(biāo)蛋白進(jìn)展定位。一般常用DAPI 復(fù)染

16、。 7封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片， 此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。防止產(chǎn)生氣泡， 方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液， 然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個(gè)拐角，接近封片液近端的拐角先降低， 直至接觸到液體時(shí)為止； 當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí)，那么可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。8切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色， 所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗延長時(shí)間和增屢次數(shù)尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是 3min*3 次，而一抗孵育后的清洗均為5 次 *5min 。注意 1單獨(dú)沖洗，防止穿插反響造成污染。 2溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡

17、用浸洗方式；3沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。4PBS的 PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)， 當(dāng)時(shí)我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃未見特異性染色，建議PH在 7.4-7.6 濃度是 0.01M。中性及弱鹼性條件PH7-8有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件那么有利于分解； 低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度那么有利于分解9拍照：有條件的話最好立即拍照，假設(shè)不能及時(shí)拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。 使用熒光顯微鏡注意嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)展操作，不要隨意專業(yè)資料整理WORD格式改變程序； 應(yīng)在暗室中進(jìn)展檢查；防止紫外線對眼睛的損害

18、，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡；檢查時(shí)間每次以12h 為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射35min 后，熒光也明顯減弱或褪色；激發(fā)光長時(shí)間的照射，會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象；所以最多不得超過23h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開場就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再啟用時(shí)，須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)防止數(shù)次點(diǎn)燃光源。關(guān)閉汞燈至少在開啟15-30 分鐘后； 標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。假設(shè)將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)；使用的玻片

19、等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發(fā)熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩(wěn)壓器，否那么電壓不穩(wěn)不僅會(huì)降低汞燈的壽命，也會(huì)影響鏡檢的效果。已有的常見免疫組化難題集錦1、石蠟切片和冰凍切片的比較？1要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，這是今天我向一教師請教得出的結(jié)論。因?yàn)樽魇炃衅瑫r(shí)要高溫烤片，可能會(huì)破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，那么可作石蠟切片； 但是要求做石蠟切片的， 可作冰凍切片。2冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時(shí)不需抗原修復(fù)這一步。 缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞構(gòu)造，可能會(huì)使抗原彌散； 切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的

20、漂亮。當(dāng)你買一抗時(shí)，目錄上都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。3石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)構(gòu)造，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到 4 微米左右， 所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功， 而且得到的顏色 / 形態(tài)都較冰凍切片好。2、一抗的選擇要點(diǎn)和技巧是什么？1單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合， 就像導(dǎo)彈準(zhǔn)確地命中目標(biāo)一樣。

21、另一方面，即使是同一個(gè)抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種克隆來產(chǎn)生抗體， 形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。 在抗原抗體反響中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色可以通過封閉等防止。 2應(yīng)用X圍的選擇。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至說明石蠟切片或冰凍切片。3種屬反響性的選擇 speciesreactivity 。這一點(diǎn)很重要， 說明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測哪種種屬動(dòng)物體內(nèi)的抗原。 (4) 種屬來源， 一般兔

22、來源的多是多克?。欢∈髞碓吹亩嗍菃慰寺?，但也有另外。根據(jù)此來源來選擇相應(yīng)的二抗。(5)生產(chǎn)廠家的選擇。如santa Cruz公司抗體一般 1ml ，價(jià)格 2100 元左右；而chemicon 公司一抗一般100ul ，價(jià)格 2800 元左右。 這兩個(gè)廠家的同一種抗體它的實(shí)際效價(jià)穩(wěn)定是不同的，我一般用后者抗體做免疫組化效果較好，而前者做 Western blotting效果還可以。3、在什么情況下使用TritonX-100？1Triton X-100化學(xué)名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(xué)(>10um 厚切片 )和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用Triton X-100作為細(xì)胞通透

23、劑，在膜上打孔。2其作用原理：Triton X-100可以溶解細(xì)胞膜、 細(xì)胞核膜、 細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子構(gòu)造的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。3)TritonX-100 既是一種外表活性劑，也有抗氧化作用，具體參專業(yè)資料整理WORD格式閱：:/專業(yè)資料整理WORD格式4、封閉血清的選擇原那么是什么？ 1膜上或切片上有剩余的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性！ 2封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動(dòng)物自身的抗體， 預(yù)先能和組織中有穿插反響的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，否那么在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合，會(huì)造成背景。

24、3也可以用小牛血清、 BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。5、抗體孵育條件的比較？ 1一抗孵育溫度有幾種：4 度、室溫、 37 度，其中4 度效果最正確；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37 度 1-2h ，而 4 度過夜和從冰箱拿出后 37 度復(fù)溫 45min 。 2二抗一般室溫或 37 度 30min-1h，具體時(shí)間需要摸索。6、一抗 4 度孵育后為什么要進(jìn)展37 度復(fù)溫？ 1一方面，防止切片從 4 度直接放入 PBS易脫片； 2另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要, 但對表達(dá)較弱的抗原可能有用 ,4 度和 37 度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同, 前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者,

25、后者結(jié)合更快 , 但敏感性也提高了并易造成非特異染色。3其實(shí)，我更贊同后一種說法，因?yàn)槲覈L試把肝臟或睪丸片子從4 度過夜拿出后， 直接用 PBS洗沒發(fā)生過脫片現(xiàn)象。 事實(shí)勝于雄辯！7、 DAB顯色時(shí)間如何把握？ 1 DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗； 2 DAB顯色時(shí)間很短如幾秒或幾十秒就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間； 3此外，假設(shè)很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全， 需要延長封閉時(shí)間； 4DAB顯色時(shí)間很長 如超過十幾分鐘才出現(xiàn)陽性染色， 一方

26、面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時(shí)間過短最好一抗 4 度過夜；另一方面就是封閉時(shí)間過長。8、免疫組化結(jié)果如何分析？1陽性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在40* 光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的 10 個(gè)視野，人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽性著色細(xì)胞，每組36 X不同動(dòng)物組織切片，然后進(jìn)展組間比較即可。 2灰密度分析法。通過在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區(qū)域、一樣條件下用image j進(jìn)展灰密度分析，然后進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析即可。3評分法。通過在光學(xué)顯微鏡下對組織切片分別按染色程度03 分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色、陽性X圍進(jìn)展評分14 分為 025%、 2650%、5175%、76100%，最終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)展比較。

27、對于以上這幾種方法，各有利弊，請細(xì)心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。9、在什么情況下進(jìn)展組織抗原修復(fù)，抗原修復(fù)的條件是什么？1由于組織中局部抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。2修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為假設(shè)干種具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH 的等。 3微波修復(fù)，我們一般用6min*4次，效果不錯(cuò)。10、內(nèi)源性過氧化物酶的滅活時(shí)間和濃度是什么？1一般 3%過氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)， 可以 10

28、min 左右； 而 0.3%過氧化氫那么可以適當(dāng)延長封閉時(shí)間，一般 1030min 。2用西奈山環(huán)保組織固定液配置過氧化氫比雙蒸水或PBS能更好保護(hù)抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時(shí)間過長易引起脫片。3現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4 度避光保存。11、如何才能充分脫蠟？1蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會(huì)引起染色不均勻、陽性物時(shí)隱時(shí)現(xiàn)、真假難辨、背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強(qiáng)，脫蠟時(shí)間較短； 2脫蠟的時(shí)間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，那么脫蠟時(shí)間不需很多，3-5

29、分鐘就已足夠。如果在冬天，專業(yè)資料整理WORD格式室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，那么脫蠟時(shí)間需要延長，10-20 分鐘或更長。3當(dāng)天切的切片， 燒烤 2 小時(shí)后進(jìn)展染色， 切片帶有溫度進(jìn)展脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預(yù)先切好烤好的切片， 在染色前，還必須對切片進(jìn)展加溫10-20 分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快， 效果魁偉更好。 總之，操作時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié)， 不同的室溫， 不同的試劑來決定，脫蠟的時(shí)間，原那么上是要徹底、干凈、完全地脫去切片上的蠟。12、如何最大限度地降低組織非特異性染色？ 1縮短一抗 / 二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。2一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著

30、色，建議試用單克隆抗體看看。 3內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高含血細(xì)胞多的組織，需要通過延長滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；4非特異性組分與抗體結(jié)合， 這需要通過延長二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果； 5縮短 DAB孵育時(shí)間或降低DAB濃度 / 過氧化氫濃度等； 6適當(dāng)增加 PBS沖洗次數(shù)和浸洗時(shí)間，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要； 7防止標(biāo)本染色過程中出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。13、蘇木素復(fù)染時(shí)間的把握？ 1蘇木素復(fù)染時(shí)間要看當(dāng)時(shí)的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒- 數(shù)分鐘。不過這個(gè)如果染色不理想可以補(bǔ)救

31、的。即：染色深那么分化時(shí)間稍長些即可；染色淺那么再置于蘇木素中染色即可。 2鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。 作用不同。 片子復(fù)染完后流水振洗， 然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒一定動(dòng)作要快后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。3如果分化的顏色過淺，可以復(fù)置于蘇木素中染色。14、PBS的清洗方式選擇、次數(shù)和時(shí)間的選擇？1單獨(dú)沖洗，防止穿插反響造成污染。 臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及工程也多，如果在參加一抗孵育完后，將它們在一個(gè)缸內(nèi)洗，這樣就會(huì)造成穿插污染， 影響最后的結(jié)果。 正確的做法是單獨(dú)地進(jìn)展沖洗，沖洗的 PBS為一次性，保證切片沒有相互穿插污染的時(shí)機(jī)。 2溫柔沖洗，防止切片的脫落。沖洗切

32、片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來，不要拿起切片將 PBS對準(zhǔn)切片沖洗， 這樣由于沖出的 PBS有一定的沖擊力， 很容易使切片周邊引起松動(dòng)，導(dǎo)致切片的脫落。3沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結(jié)合的各種物， 使之不產(chǎn)生背景， 此種做法一是浪費(fèi)時(shí)間， 二是很容易導(dǎo)致切片的脫落。切片的沖洗據(jù)實(shí)踐認(rèn)為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，無需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS，持續(xù)2 分鐘左右就完全足夠了。4 PBS的 PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。X彥仿指出：中性及弱鹼性條件 PH7 8有利于免疫復(fù)合

33、物的形成， 而酸性條件那么有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度那么有利于分解。免疫組化PBS我們目前常用的PBS的 PH在 7.4-7.6 濃度是 0.01M，根據(jù)本室十幾年來的使用情況，認(rèn)為該溶液價(jià)格廉價(jià)配制方面，使用效果好。 5常用試劑的配制和使用。在免疫組織化學(xué)的染色過程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因?yàn)榍衅谡麄€(gè)染色中，抗體的加、換、切片的沖洗，DAB的配制都離不開緩沖液。 可見緩沖液在整個(gè)染色中都起至關(guān)鍵的作用，緩沖液的過酸或偏堿，都將影響染色的結(jié)果。15、脫片產(chǎn)生的原因和如何防止脫片？ 1多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。我原先是買的， 邁新按說也是不錯(cuò)的，可是都脫成什么樣子了。后面補(bǔ)做第二批時(shí)用的病理科老師自己做的片子，要好一點(diǎn)。2組織切的不好，切片機(jī)的問題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。3組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。 4沒烤好，時(shí)間短溫度不夠之類。 5操作的時(shí)候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。6修復(fù)的問題