1、1 2找答案？找答案？核酸分離純化的原則是什么？為防止核酸分離純化的原則是什么？為防止核酸降解需要注意什么？核酸降解需要注意什么？核酸制備基本步驟？核酸制備基本步驟？如何鑒定核酸濃度和純度？如何鑒定核酸濃度和純度？核酸的保存方法有哪些？核酸的保存方法有哪些？3前言前言 核酸核酸（nucleic acid）是以核苷酸為基本組成單位是以核苷酸為基本組成單位的生物信息大分子。是遺傳信息的攜帶者，是基的生物信息大分子。是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。4核酸的分類：核酸的分類：n DNA q核內(nèi)染色體核內(nèi)染色體 DNA。q核外也有少量核外也有少量DNA，如線粒體，如線粒體DN

2、A，葉綠體，葉綠體DNA。q質(zhì)粒質(zhì)粒DNA。n RNAq存在于細(xì)胞質(zhì)中，如存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA, rRNA, tRNA等。等。n 除上述除上述DNA，RNA外，還有非細(xì)胞形式存在的病外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有，或只含有RNA。5主要內(nèi)容主要內(nèi)容2. 核酸制備的基本步驟核酸制備的基本步驟3. 核酸的鑒定和保存核酸的鑒定和保存4. 核酸提取方法簡介核酸提取方法簡介61. 1. 核酸分離與純化的原則及要求核酸分離與純化的原則及要求1.1 1.1 核酸分離與純化的一般原則核酸分離與純化的一般原則(1) 保持核酸分子保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整

3、性一級結(jié)構(gòu)的完整性，是核酸結(jié)，是核酸結(jié)構(gòu)和功能研究的最基本要求。構(gòu)和功能研究的最基本要求。 (2) 排除其他分子的污染，保證核酸的排除其他分子的污染，保證核酸的純度純度。71.2 核酸分離與純化的要求核酸分離與純化的要求(1) 為保證核酸的為保證核酸的完整性，完整性，（防止降解（防止降解），在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意：），在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意：盡量簡化步驟，縮短提取時(shí)間，減少各種盡量簡化步驟，縮短提取時(shí)間，減少各種有害因素對核酸的破壞。有害因素對核酸的破壞。減少化學(xué)因素對核酸的降解，減少化學(xué)因素對核酸的降解，pH4-10?；瘜W(xué)因素？化學(xué)因素？生物因素？生物因素？物理因素？物理因素？8防止核酸的生物降解（細(xì)胞內(nèi)或

4、外的防止核酸的生物降解（細(xì)胞內(nèi)或外的各種核酸酶水解）各種核酸酶水解）。 所用器械和一些試劑需所用器械和一些試劑需高壓滅菌高壓滅菌，提取緩沖，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。操作溫度為液中需加核酸酶抑制劑。操作溫度為04。lDNA酶酶需要金屬離子需要金屬離子Mg2+、Ca2+的激活，因此的激活，因此使用金屬離子螯合劑，如使用金屬離子螯合劑，如EDTA或檸檬酸鹽等；或檸檬酸鹽等；陰離子表面活性劑陰離子表面活性劑SDS。lRNA酶酶分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸堿、不易失活，生物降解是耐酸堿、不易失活，生物降解是RNA提取過程中提取過程中的主要危害因素。的

5、主要危害因素。0.1%DEPC浸泡，器械浸泡，器械180干烤干烤8h。9減少物理因素對核酸的降解，主要減少物理因素對核酸的降解，主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。是機(jī)械剪切力，其次是高溫。l機(jī)械剪切力包括強(qiáng)力高速的振蕩、突然暴機(jī)械剪切力包括強(qiáng)力高速的振蕩、突然暴露于低滲液、樣品反復(fù)凍融等。露于低滲液、樣品反復(fù)凍融等。l高溫，如長時(shí)間的煮沸。高溫，如長時(shí)間的煮沸。10(2) 核酸純度的要求：核酸純度的要求：非核酸生物大分子非核酸生物大分子的污染降低到最低程的污染降低到最低程度，如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子；度，如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子；排除其它核酸分子排除其它核酸分子的污染，如制備的污染，如制備RNA時(shí)

6、，時(shí)，DNA分子是污染物；分子是污染物；去除對后續(xù)實(shí)驗(yàn)有影響的物質(zhì)，如有機(jī)去除對后續(xù)實(shí)驗(yàn)有影響的物質(zhì)，如有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子。溶劑和過高濃度的金屬離子。112. 核酸制備的基本步驟核酸制備的基本步驟I. I.材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備II.II.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放III.III.核酸分離核酸分離IV.IV.沉淀或吸附核酸，純化并去除雜質(zhì)沉淀或吸附核酸，純化并去除雜質(zhì) V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中122.1 破碎細(xì)胞 (1)(1)玻璃勻漿器勻漿玻璃勻漿器勻漿(2)(2)液氮研磨法液氮研磨法富含富含DNADNA酶的胰、脾、胸腺、淋巴；酶的

7、胰、脾、胸腺、淋巴；富含膠原蛋白的皮膚、肌腱；富含膠原蛋白的皮膚、肌腱；堅(jiān)硬的組織如骨骼。堅(jiān)硬的組織如骨骼。13(3)(3)高速組織搗碎機(jī)搗碎高速組織搗碎機(jī)搗碎(4)(4)超聲波處理法超聲波處理法(5)(5)化學(xué)處理法化學(xué)處理法(SDS(SDS、吐溫、吐溫8080等）等）(6)(6)生化法（溶菌酶、纖維素酶等）生化法（溶菌酶、纖維素酶等）142.2 2.2 核酸分離，去除蛋白核酸分離，去除蛋白 核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力( (核酸與堿性蛋白的結(jié)合核酸與堿性蛋白的結(jié)合) )、氫鍵和非極性的范德、氫鍵和非極性的范德華力。華力。 分離核酸最困難的是將

8、與核酸緊密結(jié)合的蛋白分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時(shí)避免核酸降解。質(zhì)分開，同時(shí)避免核酸降解。15（1）加入加入SDS SDS SDS除有破膜和抑制核酸酶的作用外，還具有除有破膜和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；（2） 加入濃鹽溶液（如加入濃鹽溶液（如NaCl） 核酸核酸- -蛋白質(zhì)加入蛋白質(zhì)加入NaClNaCl后，破壞靜電吸力，使后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；氫鍵破壞，核蛋白解聚；16（3）酚）酚/氯仿抽提氯仿抽提p酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對

9、核酸酶有抑制作用。制作用。p氯仿比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中氯仿比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時(shí)氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。的酚，同時(shí)氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。p在酚在酚/ /氯仿抽提核酸提取液時(shí)，需要振搖，氯仿抽提核酸提取液時(shí)，需要振搖，為防止起泡和促使為防止起泡和促使水相與有機(jī)相的分離水相與有機(jī)相的分離，再加上一定量的異戊醇（，再加上一定量的異戊醇（酚：氯：異酚：氯：異戊醇戊醇=25=25：2424：1 1）。）。17 (1(1）使用注意）使用注意 酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或

10、黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。，因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。 (2(2）安全操作）安全操作 酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時(shí)應(yīng)作時(shí)應(yīng)戴手套戴手套。使用酚時(shí)應(yīng)注意使用酚時(shí)應(yīng)注意182.3 沉淀核酸沉淀核酸n重新調(diào)整核酸的濃度，起到重新調(diào)整核酸的濃度，起到濃縮核酸濃縮核酸的作用；的作用； n去除去除溶液中某些鹽離子與溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)雜質(zhì)；n改變核酸的溶解緩沖液。改變核酸的溶解緩

11、沖液。DNA純化柱純化柱核酸提?。x心柱型）核酸提取（離心柱型）利用硅膠膜特異利用硅膠膜特異吸附核酸吸附核酸19Na+Mg2+Li+2.3.1 核酸的有機(jī)溶液沉淀法核酸的有機(jī)溶液沉淀法 當(dāng)核酸溶液的當(dāng)核酸溶液的pH值值大于大于4時(shí)，核酸分子呈時(shí)，核酸分子呈多聚陰離子狀態(tài)。多聚陰離子狀態(tài)。 鉀、鈉、鎂、鋰及銨鉀、鈉、鎂、鋰及銨根等根等陽離子形成的鹽陽離子形成的鹽，通過屏蔽帶通過屏蔽帶負(fù)電的磷酸負(fù)電的磷酸基團(tuán)基團(tuán)使使DNADNA分子聚結(jié)在分子聚結(jié)在一起而不溶于許多有機(jī)一起而不溶于許多有機(jī)溶劑溶劑。20 核酸沉淀的鹽類及濃度核酸沉淀的鹽類及濃度鹽鹽貯存液濃度（貯存液濃度（mol/L)終濃度終濃度(m

12、ol/L)MgCl210.01NaAc3 (pH5.2)0.3KAc3 (pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.821乙醇乙醇n優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除易揮發(fā)除去，不影響以后實(shí)驗(yàn)。去，不影響以后實(shí)驗(yàn)。n缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 需要量大，一般要求低溫操作。需要量大，一般要求低溫操作。常用的有機(jī)沉淀劑常用的有機(jī)沉淀劑22異丙醇異丙醇n優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 需體積小，需體積小，速度快速度快，適于濃度低、體積大的，適于濃度低、體積大的DNADNA樣品沉淀。一般不需低溫長時(shí)間放置。樣品沉淀。一般不需低溫長時(shí)間放置。n缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：

13、易使鹽類、蔗糖與易使鹽類、蔗糖與DNADNA共沉淀異丙醇難以揮共沉淀異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，發(fā)除去。所以，最后用最后用7070乙醇漂洗數(shù)次乙醇漂洗數(shù)次。23聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 可用不同濃度的可用不同濃度的PEGPEG選擇沉淀不同相對分子質(zhì)量選擇沉淀不同相對分子質(zhì)量的的DNADNA片段片段。應(yīng)用。應(yīng)用60006000相對分子質(zhì)量的相對分子質(zhì)量的PEGPEG進(jìn)行進(jìn)行DNADNA沉淀時(shí)，使用濃度與沉淀時(shí)，使用濃度與DNADNA片段的大小成反比。片段的大小成反比。注意：注意： PEGPEG沉淀一般需加沉淀一般需加0.5mol/L0.5mol/L的的NaClNaCl或或10

14、 mmol10 mmol/L/L的的MgClMgCl2 2。24精胺精胺 精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效沉淀精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效沉淀DNADNA。 原理是：原理是： 精胺與精胺與DNADNA結(jié)合后，使結(jié)合后，使DNADNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與與DNADNA分開，達(dá)到純化分開，達(dá)到純化DNADNA的目的。的目的。25 2.3.2 2.3.2 核酸沉淀的溫度和時(shí)間核酸沉淀的溫度和時(shí)間 一般強(qiáng)調(diào)，核酸沉淀一般強(qiáng)調(diào)，核酸沉淀在低溫長時(shí)間下進(jìn)行在低溫長時(shí)間下進(jìn)行。但時(shí)間過長，易導(dǎo)致鹽與但時(shí)間過長，易導(dǎo)致鹽

15、與DNADNA共沉淀，影響以共沉淀，影響以后的實(shí)驗(yàn)。一般使用后的實(shí)驗(yàn)。一般使用00冰水，冰水，10-15min10-15min， DNADNA樣品足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。樣品足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。263. 3. 核酸的濃度和純度的測定核酸的濃度和純度的測定 3.1 3.1 紫外分光光度法鑒定核酸紫外分光光度法鑒定核酸 3.2 3.2 熒光光度法鑒定核酸熒光光度法鑒定核酸273.1 3.1 紫外分光光度法鑒定核酸紫外分光光度法鑒定核酸 3.1.1 3.1.1 紫外分光光度法測紫外分光光度法測DNADNA和和RNARNA的含量的含量 前提：前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂核酸樣品要較純，無顯著蛋

16、白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。糖及其他核酸污染。測定濃度應(yīng)大于測定濃度應(yīng)大于0.25 g/ml 。結(jié)論：結(jié)論：在在波長波長260nm260nm紫外光下，紫外光下，1 OD1 OD值的吸光度相值的吸光度相當(dāng)于雙鏈當(dāng)于雙鏈DNADNA濃度為濃度為50 g50 g/ml/ml；單鏈；單鏈DNADNA為為37 37 gg/ml/ml；RNARNA為為40 ug40 ug/ml/ml。28紫外分光光度計(jì)測定核酸濃度紫外分光光度計(jì)測定核酸濃度的操作步驟的操作步驟a a分光光度計(jì)分光光度計(jì)先用一定量的水校正零點(diǎn)先用一定量的水校正零點(diǎn)。b b吸取一定量的吸取一定量的DNADNA樣品或樣品或RNARNA樣品，

17、加入到盛有一樣品，加入到盛有一定體積水的石英比色杯中。定體積水的石英比色杯中。29c c測定待測樣品在測定待測樣品在230nm230nm、260nm260nm和和280nm280nm的的ODOD值值d d計(jì)算濃度。計(jì)算濃度。 雙鏈雙鏈DNADNA樣品濃度樣品濃度(g/l(g/l) = OD) = OD260260核酸核酸稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) 50/1000 50/1000； RNARNA樣品濃度樣品濃度(g/l(g/l) ) = OD= OD260260核酸稀釋倍數(shù)核酸稀釋倍數(shù)40/100040/1000。e e分析純度。分析純度。核酸定量儀核酸定量儀可直接獲得濃度，可直接獲得濃度，不用計(jì)算。不用

18、計(jì)算。小分子雜質(zhì)小分子雜質(zhì)核酸核酸蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)30核酸的紫外吸收光譜核酸的紫外吸收光譜超微量核酸超微量核酸定量儀定量儀更加方便更加方便31A：測測DNA： 純的純的DNA樣品樣品OD260/OD280=1.8 （1.71.9） OD260m/OD2302.01) OD260/OD2801.9, RNA污染。污染。2) OD260/OD2801.6，存在蛋白質(zhì)或酚污染；，存在蛋白質(zhì)或酚污染；3) OD260/OD2302.0OD260/OD2302.01 1）OD260/OD280OD260/OD280比值太小，蛋白質(zhì)或酚的污染；比值太小，蛋白質(zhì)或酚的污染；2 2）OD260/OD280 2.0

19、OD260/OD280 2.0，可能被異硫氰酸胍等污染；，可能被異硫氰酸胍等污染；3 3）OD260/OD2302.0OD260/OD2302.0，表明有小分子及鹽存在。，表明有小分子及鹽存在。333.2 3.2 熒光光度法鑒定核酸熒光光度法鑒定核酸 3.2.13.2.1 測定核酸含量：測定核酸含量：原理：原理：DNADNA、RNARNA在熒光染料溴乙錠在熒光染料溴乙錠(EB)(EB)嵌入堿基平面嵌入堿基平面之間后，之間后，DNADNA、RNARNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用一系列色熒光，熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用一系列已

20、知的不同濃度已知的不同濃度DNADNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對照，可比較出被測溶液作標(biāo)準(zhǔn)對照，可比較出被測DNADNA溶液濃度。溶液濃度。 注意：注意：此法的比較主要基于目測，是估計(jì)水平。此法的比較主要基于目測，是估計(jì)水平。常用的熒光染料還有常用的熒光染料還有:golden view, gel red, sybr green343.2.2 3.2.2 熒光光度法鑒定核酸純度熒光光度法鑒定核酸純度原理：原理：溴化乙錠溴化乙錠(EB)(EB)等熒光染料示蹤的核酸等熒光染料示蹤的核酸電電泳泳結(jié)果。結(jié)果?；蛞蚪M組DNARNA35核酸鑒定實(shí)際常用操作程序核酸鑒定實(shí)際常用操作程序核酸定量儀測定濃度，核酸定量儀測定

21、濃度，OD260/OD280及及OD260/OD230比值。比值。瓊脂糖電泳，瓊脂糖電泳，UV下觀察下觀察驗(yàn)證純度及判斷是否降解驗(yàn)證純度及判斷是否降解36(1) (1) 對對DNADNA DNADNA樣品溶于樣品溶于pH8.0pH8.0的的TETE，4 4 或或-20 -20 保存保存； 長期保存樣品中可加入長期保存樣品中可加入1 1滴氯仿。滴氯仿。(2) (2) 對對RNARNA RNA RNA樣品溶于樣品溶于0.3 mol/L NaAc0.3 mol/L NaAc (pH5.2) (pH5.2)或雙蒸滅菌水中，或雙蒸滅菌水中，-70 -70 保存保存; ; 可以沉淀形式貯于乙醇，可在可以沉

22、淀形式貯于乙醇，可在-20 -20 中長期保存中長期保存; ; 最常用無最常用無RnaseRnase水或高壓后的水或高壓后的DEPCDEPC水溶解水溶解RNARNA，凍貯于，凍貯于-70-80 。3.3 3.3 核酸的保存核酸的保存TE：Tris-Cl, EDTA374 4、核酸提取方法簡單介紹、核酸提取方法簡單介紹4.1 基因組基因組DNA的提取方法的提取方法4.2 質(zhì)粒的提取和純化質(zhì)粒的提取和純化4.3 Trizol法提取總法提取總RNA384.1 基因組基因組DNA的提取方法的提取方法4.1.1 酚抽提法酚抽提法以含以含EDTA、SDS及及RNase的的裂解緩沖液裂解細(xì)胞，裂解緩沖液裂解

23、細(xì)胞，經(jīng)經(jīng)蛋白酶蛋白酶K處理后，用處理后，用pH8.0的的Tris飽和酚飽和酚抽提。抽提。（DNA）39原理：原理：n在正常情況下，核酸表面覆蓋了一層由水分子組在正常情況下，核酸表面覆蓋了一層由水分子組成的親水薄膜，以維持其水溶性。成的親水薄膜，以維持其水溶性。高濃度鹽高濃度鹽離子離子的加入破壞了核酸表面親水薄膜的相對有序排列，的加入破壞了核酸表面親水薄膜的相對有序排列，形成了疏水環(huán)境。在此環(huán)境中，形成了疏水環(huán)境。在此環(huán)境中，核酸與硅膠膜能核酸與硅膠膜能有效結(jié)合，而蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和其他污染物則有效結(jié)合，而蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和其他污染物則不能結(jié)合。不能結(jié)合。特點(diǎn)：特點(diǎn)： n 不需要使用有毒的苯酚

24、等試劑，也不需要乙醇沉不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。淀等步驟。n 快速，簡捷。快速，簡捷。4.1.2 基因組基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取試劑盒（離心柱型）常用的試劑盒：Qiagen40裂解液裂解液+蛋白酶蛋白酶K裂解細(xì)胞裂解細(xì)胞緩沖液緩沖液GB+乙醇乙醇DNA柱子吸附柱子吸附緩沖液緩沖液GD去除蛋白去除蛋白漂洗液漂洗液漂洗漂洗DNA兩次兩次洗脫液洗脫液TE洗脫洗脫DNA離心柱型離心柱型基因組基因組DNA提取步驟提取步驟41n甲酰胺解聚法：細(xì)胞裂解步驟與酚抽提法一致，甲酰胺解聚法：細(xì)胞裂解步驟與酚抽提法一致，但以高濃度甲酰胺裂解液裂解但以高濃度甲酰胺裂解液裂解DN

25、A與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)復(fù)合體，再以透析除去雜質(zhì)復(fù)合體，再以透析除去雜質(zhì)n玻璃棒纏繞法：將基因組玻璃棒纏繞法：將基因組DNA沉淀纏繞于帶沉淀纏繞于帶鉤玻璃棒上帶出，溶于鉤玻璃棒上帶出，溶于pH8.0的的TEn異丙醇沉淀法異丙醇沉淀法n玻璃珠吸附法玻璃珠吸附法4.1.3 其他的基因組其他的基因組DNA提取方法提取方法42n透析，沉淀，電泳，選擇性沉淀透析，沉淀，電泳，選擇性沉淀4.1.4 DNA4.1.4 DNA樣品的進(jìn)一步純化樣品的進(jìn)一步純化4.1.5 DNA4.1.5 DNA片段的回收片段的回收n原則：提高回收率，去除雜質(zhì)污染原則：提高回收率，去除雜質(zhì)污染n從瓊脂糖凝膠中回收：從瓊脂糖凝膠中回收：

26、 DEAE纖維素膜插片電泳法，纖維素膜插片電泳法， 電泳洗脫法電泳洗脫法 冷凍擠壓法冷凍擠壓法n從聚丙烯酰胺凝膠中回收：壓碎與浸泡從聚丙烯酰胺凝膠中回收：壓碎與浸泡434.2 4.2 質(zhì)粒的提取和純化質(zhì)粒的提取和純化n質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)：質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)：超螺旋，半開環(huán)，線性超螺旋，半開環(huán)，線性DNAn理化性質(zhì)：理化性質(zhì)：與一般核酸相似，但抗切割和與一般核酸相似，但抗切割和抗變性能力更強(qiáng)抗變性能力更強(qiáng)n所有分離質(zhì)粒所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括的方法都包括3個(gè)基本步驟：個(gè)基本步驟： 培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒質(zhì)粒DNA(有時(shí)還要求純化質(zhì)粒有時(shí)還要求純

27、化質(zhì)粒DNA，根據(jù)實(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需驗(yàn)所需)。 選擇哪一種方法主要取決于以下幾個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、選擇哪一種方法主要取決于以下幾個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株、裂解后用于純化的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)要求。大腸桿菌菌株、裂解后用于純化的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)要求。444.2.1 4.2.1 質(zhì)粒提取原理質(zhì)粒提取原理454.2.2 4.2.2 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的純化與回收的純化與回收n純化純化qCsCL-EB法法q聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法q柱層析法柱層析法n回收：與基因組回收：與基因組DNA類似類似464.3 RNA4.3 RNA的分離和純化的分離和純化nRNARNA易被易被RNaseRNase水解，水解，RNa

28、seRNase除細(xì)胞內(nèi)還廣泛存除細(xì)胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中nRNaseRNase分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定常穩(wěn)定n排除排除RNaseRNase的污染是的污染是RNARNA制備成功與否的關(guān)鍵制備成功與否的關(guān)鍵474.3.1 RNA4.3.1 RNA制備的條件與環(huán)境制備的條件與環(huán)境n潔凈的實(shí)驗(yàn)室潔凈的實(shí)驗(yàn)室n操作人員帶口罩，勤換手套操作人員帶口罩，勤換手套n玻璃器皿（如勻漿器）、鑷子玻璃器皿（如勻漿器）、鑷子180干烤干烤8 h或更長時(shí)間或更長時(shí)間n槍頭、槍頭、EP管管0.1%DEPC水浸泡過夜，再高水浸泡過夜，再高壓；或直接購買無壓；或直接購買無Rnase的槍頭和的槍頭和EP管管n冰上勻漿，冰上勻漿，4 離心離心48nT