1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上 沙門氏菌快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展摘 要：沙門氏菌是食品中最常見的致病菌，是導(dǎo)致食物中毒的重要病原菌之一，嚴(yán)重危害人類的健康安全和食品安全。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測耗時繁瑣，不能滿足當(dāng)今發(fā)展的需求。本文簡要介紹了近年來沙門氏菌快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展，并分析各種檢測方法的優(yōu)缺點，以期尋找一種快速、簡便、特異、靈敏，能檢測絕大多數(shù)血清型沙門氏菌的方法。關(guān)鍵詞：沙門氏菌；快速檢測、免疫學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)Research Progress on the Rapid Detection of SalmonellaZhao Hui(College of Food Science and E

2、ngineering , Northwest A&F University , Yangling, Shaanxi , China) Abstract：Salmonella is the most common pathogenic bacteria in food, which can cause bromatoxism and bring about hazard on human , The traditional bacteriology detections have not bee satisfied the requirement of development

3、because of time -consuming. This review briefly introduced research progress of the rapid detection of Salmonella in recent years and analyzed the advantages and disadvantages of various detection methods，hoping to find a fast，simple，specific and sensitive method that could detect the majority serot

4、ypes of SalmonellaKeywords: salmonella；rapid detection；immunological techniques；molecular biological techniques隨著國民經(jīng)濟的發(fā)展，食品、海產(chǎn)品中存在的衛(wèi)生隱患問題愈發(fā)嚴(yán)重，在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌引起的中毒病例占首位或第 2 位，在中國，每年由沙門氏菌引起的食物中毒事件占到全部食物中毒事件的40% -60%1。沙門氏菌是常見的重要食源性致病菌，它們廣泛分布在河口、海水及沉積物、水產(chǎn)養(yǎng)殖等區(qū)域，寄生在海洋生物體中，通過污染的動物源性食品感染人類，導(dǎo)致食物中毒，嚴(yán)重危害人體健康。

5、目前我國食品中致病菌的檢驗普遍采用傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢驗方法和血清學(xué)方法，這些方法一般都復(fù)雜繁瑣、耗時費力，大致需要 4 d6 d 才能出檢驗結(jié)果，難以應(yīng)對突發(fā)事件的發(fā)生。因此，建立一些快速、簡便、準(zhǔn)確度高的檢測方法一直是沙門氏菌檢測研究的核心問題。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，在食源性致病菌檢測領(lǐng)域出現(xiàn)了許多比傳統(tǒng)方法更快捷、敏感性更好的新技術(shù)，如免疫學(xué)檢測技術(shù)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)等。本文總結(jié)了一些食品中沙門氏菌的快速檢測方法，從以傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)發(fā)展到以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的或以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測方法，以期加快檢測工作的進(jìn)行2。1 免疫學(xué)檢測技術(shù)在所有食品中的沙門氏菌的檢測技術(shù)手段中，免疫學(xué)檢測技術(shù)占有重要

6、的地位，主要是因為其價格低廉，不需要特定的實驗儀器，容易在基層推廣開來。免疫學(xué)技術(shù)以抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過病原體刺激機體產(chǎn)生免疫球蛋白（抗體），再輔以免疫放大技術(shù)來進(jìn)行檢測。抗原和抗體的結(jié)合反應(yīng)可在很短時間內(nèi)完成，同時由于敏感的標(biāo)記技術(shù)及示蹤技術(shù)的應(yīng)用，使得沙門氏菌可在較短的時間內(nèi)超微量而特異地檢出。目前已建立的沙門氏菌免疫學(xué)檢測方法主要有以下幾種：1.1免疫熒光技術(shù)(IFT)免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理, 先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,制成熒光抗體, 再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體) 在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)

7、記的熒光素, 利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本, 熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。免疫熒光技術(shù)主要有直接法和間接法。直接法是在檢測樣品上直接滴加已知特異性熒光標(biāo)記的抗血清，經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。直接法還可以清楚地觀察抗原并用于定位標(biāo)記觀察。趙文學(xué)3等直接將沙門氏菌固定在載玻片上,再用熒光標(biāo)記抗體染色,通過熒光顯微鏡觀察染色效果,建立了沙門氏菌直接免疫熒光檢測技術(shù),該技術(shù)染色程序簡單、操作方便,具有一定的應(yīng)用價值。間接免疫熒光法在實踐中用途較廣，是在檢樣上滴加已知的細(xì)菌特異性抗體，待作

8、用后經(jīng)洗滌，再加入熒光標(biāo)記的第二抗體，一抗與結(jié)合有熒光色素的二抗結(jié)合，所發(fā)出的熒光可由免疫熒光顯微進(jìn)行檢測。黃愈玲4等人進(jìn)行了間接免疫熒光技術(shù)快速檢測沙門氏菌的研究,實驗結(jié)果表明沙門氏菌經(jīng)免疫熒光染色后,其形態(tài)結(jié)構(gòu)與革蘭氏染色的沙門氏菌相同，檢測樣品經(jīng)丙酮固定化和一抗二抗分別作用30min后,用FITC標(biāo)記物對其染色,通過熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果,檢測結(jié)果與常規(guī)檢測方法一致。此檢測方法具有操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏、快速等優(yōu)點,有較強的應(yīng)用價值。1.2酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)是建立在免疫酶基礎(chǔ)上的一種新型免疫測定技術(shù)，具有特異性強、敏感性高等優(yōu)點，可以在短時間內(nèi)準(zhǔn)確地將有害微生物

9、檢測出來。其基本原理是把抗原（抗體）預(yù)先結(jié)合在某種固相載體表面，然后加入受檢樣品和酶標(biāo)抗原（抗體），使其與結(jié)合在固相載體上的抗原（抗體）發(fā)生反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌去除反應(yīng)液中其他物質(zhì)，加入酶反應(yīng)底物后，底物被固相載體上的酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，顏色反應(yīng)的深淺與樣品中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正相關(guān)5。故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性分析或通過酶標(biāo)儀進(jìn)行定量測定。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。20 世紀(jì) 80 年代, 建立了抗沙門氏菌各種 O 抗原、H 抗原單抗技術(shù),取代常規(guī)因子血清進(jìn)行血清學(xué)鑒定。沙門氏菌研究者獲得了4株具有沙門氏菌廣譜結(jié)合特性的單克隆

10、抗體,其中2株的反應(yīng)互補, 對已檢菌株覆蓋率達(dá)到99%,而對其它受試腸桿菌均無交叉反應(yīng)。文其乙6等在前人基礎(chǔ)上應(yīng)用沙門氏菌屬特異性單克隆抗體 CB8和de7 建立了檢測沙門氏菌的直接 ELISA方法, 并形成了快速檢測試劑盒, 此外, 還應(yīng)用直接 ELISA 方法對500 份蛋品檢測, 結(jié)果表明該方法可靠, 且陽性率比國標(biāo)方法高。田銀芳等應(yīng)用直接 ELISA 法對350份奶樣進(jìn)行沙門氏菌的檢測, 與常規(guī)方法相比,該法的靈敏度和特異性分別為100%和 99.7%；楊愛萍等也成功地用單抗酶聯(lián)試劑盒檢測鮮牛奶、熟食制品等樣品中的沙門氏菌7。此外Wilanee8等人通過碳納米管技術(shù)結(jié)合ELISA方法檢

11、測鼠傷寒沙門氏菌,普通ELISA檢測方法靈敏度為106-107CFU/rnL,為了提高檢測靈敏度,采用SWCNTs標(biāo)記抗體結(jié)合HRP進(jìn)行檢測,靈敏度提高到103-104CFU/rnL,靈敏度提高了1000多倍9。大量的試驗結(jié)果表明，單抗直接法靈敏度高、特異性強，可避免人為因素造成的假陰性，且能在短時間內(nèi)快速篩去大量的陰性樣品，檢測周期短，且不需昂貴儀器，易于操作，便于推廣。1.3免疫磁珠分離技術(shù)(IMS)隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,抗體制備技術(shù)取得了重大突破,促進(jìn)了免疫磁珠的出現(xiàn)和發(fā)展。免疫磁珠分離技術(shù)是一種免疫學(xué)富集分離技術(shù),它是以高度均一的磁性微球為固相載體,免疫配基通過功能基團偶聯(lián)到磁珠表面

12、形成免疫磁球,通過抗體抗原特異性免疫學(xué)反應(yīng),在磁場力作用下,發(fā)生動力學(xué)移動,從混合溶液中富集分離目的沙門氏菌10。該方法具有特異性強、分離樣品快、儀器設(shè)備操作簡單等特點。IMS 法與一般的細(xì)菌培養(yǎng)分離方法相比，可以極大地提高環(huán)境樣品與食品中病原性副溶血性弧菌的檢出率。不過，IMS目前還存在一定的局限，比如價格昂貴，且易出現(xiàn)交叉反應(yīng)等情況，因此需要其他技術(shù)手段輔助檢測。2分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)檢測技術(shù)具有高靈敏度、高特異性、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點,成為生物技術(shù)革命的新產(chǎn)物,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的快速檢測?？焖贆z測沙門氏菌的分子生物學(xué)技術(shù)主要包括:聚合酶鏈反應(yīng)、核酸探針、基因芯片和LAMP等先進(jìn)技

13、術(shù)。2.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)是在體外合適條件下，以DNA 為模板，以一對人工合成的寡核苷酸為引物在耐熱 DNA 聚合酶作用下特異性擴增目的 DNA 片段的技術(shù)。近年來應(yīng)用 PCR 技術(shù)檢測食源性致病菌的技術(shù)有很多，如常規(guī) PCR11、多重 PCR12、實時熒光定量 PCR13等。2.1.1多重PCR多重PCR14可以在同一PCR反應(yīng)體系里加入多對引物,使一次PCR反應(yīng)能完成多個樣品檢測,提高檢測效率、降低檢測成本、縮短檢測周期,多重PCR在病原菌檢測方面得到廣泛應(yīng)用。相對于傳統(tǒng)檢測方法，多重PCR 檢測技術(shù)可以極大地縮短檢測時間，且操作簡單、特異性和敏感度較高。邵碧英1

14、5等利用多重PCR技術(shù)對沙門氏菌進(jìn)行檢測,試驗結(jié)果表明多重PCR方法比單一PCR更加準(zhǔn)確、穩(wěn)定、高效、經(jīng)濟。采用多重PCR技術(shù)檢測沙門氏菌,檢出限為4.5×1045.5×104cfu/ml,特異性為100%。但是多重PCR只能進(jìn)行定性檢測,對定量檢測的需求推動了RT-PCR技術(shù)的出現(xiàn)。多重 PCR 技術(shù)在實際的檢驗工作還存在一些問題：如提取得到的 DNA 片段可能不完整，多組引物之間的相互干擾，高濃度模板對低濃度模板產(chǎn)生競爭性抑制以及樣品中可能含有 PCR 抑制物質(zhì)等。2.1.2實時熒光定量 PCR（RT-PCR）熒光定量 PCR16,17不同于其他 PCR 的地方在于，它

15、不僅實現(xiàn)了對 DNA 的定量檢測， 而且具有較高的敏感性、特異性、可靠性和時效性，自動化程度高、無污染性，能夠同時完成多樣品的擴增及定量，適宜于大批樣品的檢測。RT-PCR18技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,通過分析熒光強度實現(xiàn)定量檢測,并根據(jù)熒光信號的積累情況實時監(jiān)測PCR整個擴增進(jìn)程19。RT-PCR技術(shù)在PCR擴增過程中即可檢測目標(biāo)菌的存在,不用對擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測,省略常規(guī)PCR技術(shù)的電泳步驟,避免了因電泳帶來的誤差,提高了檢測準(zhǔn)確性,并且節(jié)省檢測時間。RT-PCR與PCR技術(shù)相比,除了能進(jìn)行定量檢測、實時監(jiān)控外,其靈敏性、特異性、重復(fù)性、檢測效率都優(yōu)于PCR技術(shù),并且RT-PCR技

16、術(shù)的整個過程都由電腦控制,操作方便,一次可以處理多個樣品。王榮成20楊柳21采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行沙門氏菌檢測,驗證了其可行性。但是PCR檢測比較昂貴,特異性引物和探針的選取會影響到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,因此對實驗人員的專業(yè)技能和試驗操作技能要求高,限制了其在基層的應(yīng)用。2.2環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴增法25是在PCR基礎(chǔ)上創(chuàng)建的一種理想的手段，該技術(shù)檢測克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本高等缺點，同時比傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法快捷方便，大大節(jié)省了工作人員的時間。此外，這種檢測方法對檢測人員的技術(shù)要求較低，實際操作很簡便，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立成本低

17、廉的快速篩選體系26。該方法適用于現(xiàn)場檢測和大量樣品高通量檢測，在食品衛(wèi)生質(zhì)量檢驗等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。黃金海等27根據(jù)沙門氏菌 invA 基因核苷酸序列設(shè)計一組引物，應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，分別對7種不同血清型沙門氏菌和4種非沙門氏菌進(jìn)行擴增，同時建立沙門氏菌人工污染的食品模型，比較了 LAMP 法與活菌計數(shù)檢測的敏感性與沙門氏菌培養(yǎng)物相比，食品中沙門氏菌的檢測具有更大的難度直接用 LAMP 檢測食品中的沙門氏菌面臨的一個問題是不能將活菌和死菌區(qū)別開來由于檢測的靈敏性高，即使是樣品中存在死亡沙門氏菌的 DNA 也會產(chǎn)生陽性結(jié)果，所以建立能夠區(qū)分死菌和活菌的方法對沙門氏菌檢測較為重要因此在

18、 LAMP 檢測之前，需要選擇性增菌，以減少來自樣品中死亡沙門氏菌的 DNA 的影響，從而增加了檢測方法對樣品生物安全評估的可信度，同時也提高了食品中沙門氏菌的檢出率應(yīng)用建立的 LAMP 方法，液體樣品中沙門氏菌檢出下限為336mL-1，而常規(guī)PCR 的檢出線一般在 103105mL-1活菌水平。應(yīng)用建立的 LAMP 方法，經(jīng)增菌培養(yǎng)程序后，可檢出含菌量為8.25g-1的陽性肉品應(yīng)用LAMP方法對沙門氏菌進(jìn)行檢測，從檢測結(jié)果來看，方法特異、敏感，可有效檢測樣品中的沙門氏菌；檢驗周期短，每一批樣品從樣品準(zhǔn)備到檢出只需要2h，如果將增菌時間計算在內(nèi)，也僅需要 15h；操作簡單，檢測成本低，不需要昂

19、貴的檢測設(shè)備，檢測結(jié)果肉眼可見，可適應(yīng)國境口岸方便快捷的需要，在基層檢測中易于推廣，具有較高的實用價值因此所建立的檢測沙門氏菌方法具有較高的特異性與靈敏性，操作簡單、快速，可用于沙門氏菌污染食品的快速檢測。2.3基因芯片基因芯片又稱DNA28芯片、生物芯片。基因芯片檢測原理是雜交測序方法,即通過與一組已知序列的核酸探針29雜交進(jìn)行核酸序列測定的方法,將各種基因寡核苷酸點樣于芯片表面,微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴增后標(biāo)記探針,然后再與芯片上寡核苷酸點進(jìn)行雜交,最后通過掃描儀定量來確定檢測樣品是否存在目的菌30。該方法具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、特異性強和快速等特點,在包括沙門氏菌在內(nèi)的各種致病菌檢測中

20、具有很好的應(yīng)用前景。3小結(jié)隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的食品檢測技術(shù)層出不窮。這些技術(shù)與傳統(tǒng)檢測方法相比較而言，具有快速、簡便、特異性強等特點。沙門氏菌的傳統(tǒng)檢測方法對于需要檢測大量樣本的食品、衛(wèi)生以及獸醫(yī)部門的實驗室是一種沉重的負(fù)擔(dān)，快速檢測方法除帶來檢驗工作本身的革新外，更重要的是由此而產(chǎn)生的社會效益，如減少食品庫存費用、污染等問題得以盡快處理。目前沙門氏菌的快速檢測研究主要集中在 PCR、核酸雜交、免疫熒光、酶聯(lián)免疫 ELISA 等方法上，但單純每一種方法均存在很多缺點。如酶聯(lián)免疫吸附法能避免假陰性，但靈敏度和特異性又不及PCR；常規(guī)的PCR方法雖然符合快速簡便等要求，但是它易污染，假陽性高

21、。因此，要使快速檢驗技術(shù)廣泛應(yīng)用，擴大其檢驗適用范圍，克服假陽性和假陰性反應(yīng)，考慮生產(chǎn)實際應(yīng)用的可能性和潛在的公共衛(wèi)生等問題，實現(xiàn)相互間的聯(lián)用技術(shù)是十分必要的。應(yīng)該指出的是，快速檢測方法的應(yīng)用并不意味著完全拋棄分離培養(yǎng)方法。在某些情況下，特別是涉及一些需要最終結(jié)果的樣品時，分離培養(yǎng)方法還是必不可少的?？傊?，隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，相信對于食品中沙門氏菌的檢測技術(shù)將向著快捷、特異性強、靈敏度高、經(jīng)濟實惠的方法不斷發(fā)展。參考文獻(xiàn)1劉喆. 沙門氏菌的檢測技術(shù)進(jìn)展J.中國動物傳染病學(xué)報，2012，20( 2) :81-86.2夏慧麗.食品中3種致病菌快速檢測方法的研究進(jìn)展.食品研究與開發(fā)J.20

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