1、如何構建質?？寺∪绾螛嫿ㄙ|粒克隆周鴻雁周鴻雁2011.06.152011.06.15目的基因目的基因目的載體目的載體BaxpCMV-Sport 6EcoRBgl連接連接BaxBax基因至基因至EGFPEGFP載體載體 思路思路加入加入 EcoREcoR酶切位點酶切位點加入加入 Bgl Bgl 酶切位點酶切位點連接連接酶切酶切目的基因目的基因兩側加入兩側加入酶切位點酶切位點MCS多克隆位點多克隆位點 BaxpCMV-Sport 6: Flag、 HA、 MycpCMVSPORT6 MCSGene： BAX MGC: 20956, IMAGE:4578562Insert site：EcoRI, X

2、hoI 構建過程構建過程 設計引物設計引物 ( (增加酶切位點增加酶切位點, Bgl, EcoR), Bgl, EcoR) 目的基因目的基因PCRPCR 雙酶切載體雙酶切載體 (Bgl, EcoR)(Bgl, EcoR) 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 DNA DNA 膠回收膠回收 ( ( 基因基因 , ,載體載體) ) 雙酶切目的基因雙酶切目的基因 (Bgl, EcoR)(Bgl, EcoR) 目的基因與載體相連目的基因與載體相連 DH5DH5轉化轉化 鑒定鑒定第一步：第一步：設計目的基因設計目的基因PCRPCR引物引物目的：目的：1 1）通過）通過PCRPCR方法擴增目的基因方法擴增目的基因

3、2 2）在目的基因片斷兩端增加酶加位點）在目的基因片斷兩端增加酶加位點設計引物前需解決的問題設計引物前需解決的問題 1 1、選擇酶切位點、選擇酶切位點 2 2、選擇保護堿基、選擇保護堿基 3 3、終止密碼子、終止密碼子PEGFP MCS選擇酶切插入位點：選擇酶切插入位點：1、兩個酶切位點間隔、兩個酶切位點間隔遠遠2、目的基因序列中無、目的基因序列中無相應酶切位點相應酶切位點3、酶切緩沖液一致、酶切緩沖液一致BAX insert sequence atggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggcccaccagctctgagcagatcatgaagacaggggccctt

4、ttgcttcagggtttcatccaggatcgagcagggcgaatggggggggaggcacccgagctggccctggacccggtgcctcaggatgcgtccaccaagaagctgagcgagtgtctcaagcgcatcggggacgaactggacagtaacatggagctgcagaggatgatt gccgccgtggacacagactccccccgagaggtctttttccgagtggcagctgacatgttttctgacggcaacttcaactggggccgggttgtcgcccttttctactttgccagcaaactggtgctcaaggccct

5、gtgcaccaaggtgccggaactgatcagaaccatcatgggctggacattggacttcctccgggagcggctgttgggctggatccaagaccagggtggttgggacggcctcctctcctactttgggacgcccacgtggcagaccgtgaccatctttgtggcgggagtgctcaccgcctcactcaccatctggaagaagatgggctgaenzymeenzymeBAXBAXbufferbufferSal Sal 0 0XhoXho1 12,3,42,3,4EcoR EcoR 0 01,2,3,41,2,3,4BamHBamH

6、1 1Bgl Bgl 0 03 3PstPst0 0BclBcl0 0*DNAStar軟件軟件 - MapDraw功能功能AGATCT - Bgl buffer 3 GAATTC -EcoR I buffer 3AGATCT AGATCT 目的基因目的基因 CTTAAG CTTAAG PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物酶切位點保護堿基酶切位點保護堿基protection seqence: GGAAGATCTTCC 2h=25%, 20h90% CCGGAATTCCGG 2h90%, 20h90%切割率切割率保護堿基保護堿基: : 限制性內切酶限制性內切酶識別特定的識別特定的DNADNA序列，除此之外，酶蛋白

7、還序列，除此之外，酶蛋白還要占據(jù)識別位點兩邊的若干個堿基，這些堿基對內切酶穩(wěn)定的結合到要占據(jù)識別位點兩邊的若干個堿基，這些堿基對內切酶穩(wěn)定的結合到DNADNA雙鏈并發(fā)揮切割雙鏈并發(fā)揮切割DNADNA作用是有很大影響作用是有很大影響設計引物原則設計引物原則 引物的長度一般為引物的長度一般為15-30 bp15-30 bp，常用的是，常用的是18-27 bp18-27 bp，引物序列的引物序列的GCGC含量一般為含量一般為40-60%40-60%2. 2. 引物所對應模板位置序列的引物所對應模板位置序列的TmTm值在值在7272左右可使復左右可使復性條件最佳性條件最佳3. 3. 避免引物二聚體及發(fā)

8、夾結構避免引物二聚體及發(fā)夾結構4. 4. 引物的特異性引物的特異性5. 5. 堿基隨機分布堿基隨機分布 cggcgg tgatggacgg gtccggggag cagcccagag gcggggggcc Primer1 ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG (length -21, GC%-71.8%, Tm-71.4) ggag tgctcaccgc ctcactcacc atctggaaga agatgggctg aggcccccag Primer2 TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG (length -25, GC%-52%, Tm-68.4)設計引物設計引物 P

9、rimer 5Primer 5軟件軟件 引物中是否應包含終止密碼子？引物中是否應包含終止密碼子？加入保護堿基及酶切位點加入保護堿基及酶切位點 Primer 1 GGAAGATCT ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer 2 CCGGAATTC TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG MCSMCS與熒光相連的地方應特別注意有無移碼與熒光相連的地方應特別注意有無移碼調整開放閱讀框（調整開放閱讀框（ORF）熒光表達在前時熒光表達在前時(EGFP) Primer1 GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer2 CCGGAATTCTCAGCC

10、CATCTTCTTCCAGATGGTG 因因TGA為終止密碼子，所以之后的移碼不需理會為終止密碼子，所以之后的移碼不需理會熒光表達在后時熒光表達在后時 (DsRed) Primer1 CCGGAATTCatggaggcgctaattcctgtc Primer2 CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccgg熒光表達在后時需加熒光表達在后時需加KOZAKKOZAK 序列序列 Primer1 CCGGAATTCgccaccatggaggcgctaattcctgtc Primer2 CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccgg KOZAK KOZAK 序列序列: : g

11、ccacc, 加在起始密碼子之前加在起始密碼子之前Primer final Primer1 GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer2 CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG33.5 uL dH2O10 uL phusion HF buffer1 uL dNTP(10mM)2.5uL primer forward/ reward 1uL BAX 1.5ul DMSO0.5uL phusion polymerase 50 uL 1. 98(1min)2. 98 (5s)3. 65(20s) 4. 72(20s)5. back to

12、step 2 for 25 times6. 72 (10min)7. 18 for ever第二步：第二步：PCRPCR目的基因目的基因PhusionPhusion超保真超保真PCRPCR試劑盒試劑盒Buffer3 : 2ulvector: 4ul100%BSA: 0.2ulEcoR : 1ulBgl: 2ulddH2O: 10.8ul37 4hEcoRBgl第三步：雙酶切載體第三步：雙酶切載體20ul第四步：瓊脂糖凝膠電泳、第四步：瓊脂糖凝膠電泳、凝膠回收凝膠回收 0.6% gel 6* loading buffer 50ul sample 80V 目的基因5kb2.5kb載體瓊脂糖濃度%D

13、NA分離范圍0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.23Buffer3 : 2ulBAX: 15ul100%BSA: 0.2ulEcoR : 0.5ulBgl: 1ulddH2O: 1.3ul37 4h第五步：雙酶切及回收目的基因第五步：雙酶切及回收目的基因20ulTAKARATAKARA片斷回收試劑盒片斷回收試劑盒第六步：回收效率驗證第六步：回收效率驗證5kb2.5kbLoading volume: 5ulFrom left to right:Marker: 15000bpEGFPBAX restrictionBAX PCRMarker:100bpT4

14、ligase buffer : 2ulT4 ligase: 1ulBax: 3ul vector: 1ulddH2O: 13ulT4 ligase buffer : 2ulT4 ligase: 1ulBax : 6ul vector : 1ulddH2O: 10ulT4 ligase buffer : 2ulT4 ligase: 1ulBax : 10ul vector : 1ulddH2O: 6ul(1) (2) (3)16 過夜過夜第六步：連接第六步：連接載體載體100ng:100ng:100 x100 x目的基因分子量目的基因分子量載體分子量載體分子量X 4/110/1X 4/110/1目的基因的量為目的基因的量為: :第七步：轉化第七步：轉化 100ul DH5 + 20ul 連接產(chǎn)物第八步：驗證第八步：驗證 (1)(1) PCR1-1213-24Positive: 2,7,9,105.4 uL dH2O2 uL phusion HF buffer0.2 uL dNTP(10mM)0.5uL primer forward0.5 uL primer reward1uL 菌液稀釋液 0.3ul DMSO0.1uL phusion polymerase 10 uL 第八步：驗