1、第八章毒理學(xué)評價的分子生物學(xué)方法分子毒理學(xué)固然應(yīng)主要著眼于生物大分子，但也應(yīng)當(dāng)看到這些大分子是存在于細(xì)胞膜 上、細(xì)胞器內(nèi)，乃至細(xì)胞間隙液中的。它們與細(xì)胞是不可別離的。因此，對亞細(xì)胞組分的研 究也是毒理學(xué)分子生物學(xué)評價的重要組成部分。第一節(jié)亞細(xì)胞組分的制備現(xiàn)代毒理學(xué)中使用最多的亞細(xì)胞組分是細(xì)胞膜、微粒體及線粒體?，F(xiàn)就細(xì)胞膜、微粒體 及線粒體的制備方法加以介紹。一、細(xì)胞膜的制備細(xì)胞膜指細(xì)胞外層質(zhì)膜，厚度約610nm°它將細(xì)胞與外環(huán)境分隔，且參與細(xì)胞的生命 活動，細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器也是由質(zhì)膜分隔，稱為細(xì)胞器膜，兩者統(tǒng)稱為生物膜。它是常用的 研究模型，用以從細(xì)胞和亞細(xì)胞水平研究外源化合物的中毒

2、機制。I .肝細(xì)胞膜的制備其基本原理是：首先，將肝組織在含有鈣離子的低滲碳酸氫鈉緩沖液中溫和勻漿，使 細(xì)胞膜保持較大的膜片；其次，應(yīng)用低速離心使細(xì)胞膜片與細(xì)胞核一起從勻漿中別離，再利 用細(xì)胞膜與細(xì)胞核之間的密度差異，用密度梯度離心將細(xì)胞膜從低速離心獲得的粗核部分中 別離出來。2. 紅細(xì)胞膜的制備哺乳動物紅細(xì)胞不含任何細(xì)胞器，故其紅細(xì)胞膜是較純潔的細(xì)胞膜。(1) 紅細(xì)胞血影膜常用的制備方法是在低滲條件下，紅細(xì)胞膨脹，由雙面盤狀變成近乎球形，隨后細(xì)胞內(nèi) 容物因胞膜破裂而釋放，2() OOOg離心。洗滌去除血紅蛋白，即獲紅細(xì)胞膜。此種膜最接近 整體系統(tǒng)，仍保留著原有膜的生物化學(xué)和生物物理學(xué)等特性，毒

3、理學(xué)試驗常用簡易模型研究 外源化合物對細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運及相關(guān)酶類、膜脂流動性和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)等方面的影響，并探 討其可能的機制。但它不能控制細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的環(huán)境，在應(yīng)用上有一定的局限性。此外，低滲制 備的紅細(xì)胞膜雖然去除了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)，但膜的封閉性差，有許多泄漏的空穴。(2) 再封血影近年發(fā)現(xiàn)，在一定條件下，脹破了的紅細(xì)胞可以重新封閉，對K'等離了不通透，給研 究紅細(xì)胞膜提供了另一模式。其制備的方法有： 向低滲脹破的紅細(xì)胞加入濃鹽溶液，成為等滲溶液，置于37C溫育20min,期間可 緩慢地攪拌，即得一定比例的再封血影。 將低滲脹破的紅細(xì)胞在0°C條件下，過Biogel A柱，柱上部的I/3

4、pH為7. 6,以 利膜與血紅蛋白別離，其下的2/3pH為6. 0,有利于隨后紅細(xì)胞空泡的重新封閉，當(dāng)膜從 柱上流出后再用一定濃度的Kcl調(diào)節(jié)為等滲液，在37°C溫育lh,即獲得重新封閉的血影。(3) 封閉的紅細(xì)胞膜囊泡有時為了深入研究，需要將膜的內(nèi)、外層翻過來。紅細(xì)胞溶血后，在不含一價離子的堿 性低離子強度介質(zhì)中，膜能自發(fā)地凹陷(無Mg"存在)或外凸(有Mg “存在)，形成小囊泡， 通過實驗可制備封閉的紅胞膜囊泡。其特點是不受胞漿內(nèi)容物的干擾，可采用勻漿，等密度 梯度離心或屏障別離等技術(shù)制備胞漿面在外的翻轉(zhuǎn)泡(其內(nèi)、外層正好與血影膜相反)或胞漿 面仍在內(nèi)的正轉(zhuǎn)泡(即與紅細(xì)

5、胞膜內(nèi)外側(cè)相同的囊泡)。3. 脂質(zhì)體的制備脂質(zhì)體是雙層脂質(zhì)包圍-些水溶液的小滴，呈球形。它是最常用的人工膜之一，是較 為理想的生物膜模擬系統(tǒng)。大脂質(zhì)體制備可將適量的磷脂溶于氯仿等有機溶劑，置于旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀上蒸發(fā)至干，使玻璃壁上附有一層極薄的磷脂膜，然后加水溶液，并振搖，即可形成多檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌單核細(xì)胞增生李斯特I®是食品衛(wèi)生中的重要病原茜，多通過食品經(jīng)口感染，被列 為20世紀(jì)90年代食品中的4大病原菌之一。有關(guān)單核細(xì)胞增生李斯特菌污染乳制品、肉、 禽、蔬菜的研究國內(nèi)外均有報道。該菌可誘發(fā)食物中毒，導(dǎo)致李斯特菌病，主要引起人類腦 膜炎、菌血癥等，發(fā)病率雖低，死亡率卻高達(dá)30%

6、70%。在食品李氏桿菌的檢測中，過 去一直缺乏簡單快速的別離鑒定技術(shù)，傳統(tǒng)方法從食品中別離、鑒定該菌約需I2周才能 得出結(jié)果，免疫學(xué)方法和基因探針己用于該菌的快速檢測，但前者可到達(dá)屬水平的特異性， 后者敏感性差。PcR技術(shù)的引入可使檢測過程大為縮短。李氏溶血素0基因與內(nèi)化素基因是 單核細(xì)胞增生李斯特前最主要的致病因子與侵襲因子，針對其毒力基因可設(shè)計特異性高的引 物，快速擴增。有報道對食品中李氏桿菌的溶血?；蜻M行PcR擴增，結(jié)果可在I2h內(nèi)完 成整個檢測過程，對食品樣品中李氏桿菌的檢測限可達(dá)550個細(xì)菌。(1) 檢測金黃色葡匐球菌金黃色葡萄球菌是各種類型感染和食物中毒的病原菌，能在食物內(nèi)增殖并

7、產(chǎn)生體 外毒素一一腸毒素、內(nèi)毒素一一中毒休克綜合癥毒素和脫皮毒素。FI前金黃色葡葡球菌腸毒 素D的鑒定主要依賴于免疫學(xué)技術(shù)，該技術(shù)需要細(xì)菌純培養(yǎng)和制備腸毒素，實驗周期長、 步驟繁多，使其在食品衛(wèi)生學(xué)鑒定時受到限制。近年來PCR技術(shù)的發(fā)展為食品病原微生物 的鑒定提供了新的途徑。(2) 檢測沙門菌沙門菌是-種人畜共患的傳染性病原菌，近年來，對沙門菌快速診斷的方法己有 了很大進展，如應(yīng)用ELlsA法、EIA技術(shù)、間接血凝抑制試驗、HRPSPA染色法和PcR 技術(shù)等。PCR技術(shù)由于具備高度特異、靈敏和快速的特點，已引起越來越廣泛的重視。(3) 檜測致病性大腸桿菌腸毒素大腸桿菌是弓I起嬰幼兒和幼畜腹瀉的

8、主要病原菌之一。該菌可產(chǎn)生2種腸毒 素：熱敏性腸毒素和耐熱性腸毒素，它們均能引起腸黏膜細(xì)胞水與電解質(zhì)的代解紊亂并導(dǎo)致 腹瀉。腸毒素大腸桿菌引起的腹瀉主要是食入了被該曲污染的食品所致。PCR技術(shù)為臨床 和實驗室提供了一個更為快速靈敏的檢測手段。(4) 檢測志賀氏菌該菌的致病性主要由其質(zhì)粒決定，而傳統(tǒng)方法的選擇性富集培養(yǎng)易喪失質(zhì)粒。PcR 技術(shù)克服了這一缺。PCR擴增及凝膠電泳分析檢測中心質(zhì)粒DNA的別離，可在67h完成, 而從抽樣到最后出結(jié)果也不到1天時間。(5) 檢測肉毒梭狀芽泡桿菌肉毒梭狀芽泡桿菌產(chǎn)生的肉毒神經(jīng)毒素，在天然物質(zhì)中毒力最強。依據(jù)抗原性不 同，肉毒毒素分為A, B, C, D,

9、E, F和G7型，分別由AG型肉毒梭菌(clostridium b。 (ulinum)產(chǎn)生，其中A, B,E和F型能引起人類肉毒中毒，致死率很高。肉毒梭菌一直缺乏 有效的快速檢測方法，用常規(guī)方法從食物中別離鑒定出肉毒梭菌至少需要4d,不能到達(dá)快 速監(jiān)測食品的目的。經(jīng)設(shè)計引物擴增持異片段，實現(xiàn)了對食品中肉毒梭菌的快速、敏感、特 異性地檢測。3. 存在的問題及展望PCR技術(shù)雖為一種快速、特異、靈敏、簡便、高效的檢測新技術(shù)，但其在食品中 致毒、致病性微生物檢測的實際應(yīng)用中也存在不少問題，必須認(rèn)真分析各種具體情況，采取 必要的措施，以提高反應(yīng)的特異性和敏感性，防止假陽性或假陰性結(jié)果。(1) 污染問題。

10、PCR是一種極為靈敏的反應(yīng)，一旦有極少量外源性DNA污染，就可 能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，所以在操作時必須加以注意。(2) 假陽性問題。食品是復(fù)雜的反應(yīng)基質(zhì)，影響PCR反應(yīng)的因素很多，如果不能有 效排除各影響因素的干擾，很可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，如果在PCR操作過程中各種實 驗條件控制不當(dāng)，很容易導(dǎo)致產(chǎn)物突變，也會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。對于這些問題必須有充分的 考慮和排除措施。(3) 引物設(shè)計及靶序列選擇。引物的設(shè)計及靶序列的選擇是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵因 素，引物不同則擴增物不同，如果引物的設(shè)計不當(dāng)，則直接影響對關(guān)鍵靶序列的選擇，降低 PCR檢測的靈敏度和特異性，甚至完全失敗。因而必須對擴增序列有充分的了

11、解，并標(biāo)準(zhǔn) PCR實驗室操作計術(shù)。(4) 模板DNA的制備方法。肉類等食品增菌液中含有的油脂等雜質(zhì)可抑制Taq酶活 性，影響PCR反應(yīng)的正常進行。如用煮沸裂解法直接制備DNA模板，油脂等雜質(zhì)難以除 去，會影響檢測結(jié)果。因此，必須采用適當(dāng)?shù)哪０錎NA制備方法。有研究發(fā)現(xiàn)，采用快速 裂解吸附法制備DNA模板，經(jīng)過2次清洗步驟可有效去除雜質(zhì)，反應(yīng)干擾小，穩(wěn)定性好， 所獲得的模板可保存較長時間。(5) 靈敏度問題。食品的成分極為復(fù)雜，其中許多成分都對PCR反應(yīng)產(chǎn)生干擾作用， 從而降低PCR檢測的靈敏性。為了提高檢測的靈敏度，在PCR擴增前往往需要進行增菌培 養(yǎng)。如果不進行增菌培養(yǎng)而直接對樣品進行檢測，

12、其檢出限可相差5個數(shù)晟級。結(jié)合PCR 技術(shù)與免疫磁性別離技術(shù)建立的MIPA方法，可不經(jīng)增萌程序，提高可利用模板數(shù)量，去除 食品成分干擾，到達(dá)較好的檢測靈敏度。(6) 檢測效果。PCR方法只能檢測微生物的存在與否，而不能檢測微生物產(chǎn)生的毒 素，因而PcR技術(shù)用于致毒性微生物污染的食品的安全性檢測方面，尚存在兩個問題。其 一，致毒性微生物檢測結(jié)果為陰性的食品并不能排除存在毒素的可能，因此檢測結(jié)果為陰性 的食品并不一定是食用安全的食品：其二，致毒性微生物檢測結(jié)果為陽性的食品中不一定都 含有微生物毒素。對前一種情況，PcR檢測不具診斷價值，需用小鼠致死試驗或免疫學(xué)方法 檢測毒素。對后一種情況，PcR檢

13、測具有參考價值，因為食品中存在引起食物中毒的潛在因 素。這說明，對于致毒性微生物安全性的檢測，不能僅以PcR的檢測結(jié)果為依據(jù)，還需要 結(jié)合對毒素物質(zhì)的檢測結(jié)果進行綜合判斷。盡管PcR技術(shù)在食品的微生物安全性檢測方面還存在著-些問題，但相信隨著研 究的深入，這項技術(shù)必將得以完善，并迅速成為可以信賴的快速檢測手段。三、轉(zhuǎn)基因食品PCR檢測自1983年世界上試驗成功第一棵轉(zhuǎn)基因植物以來，以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物 技術(shù)迅猛發(fā)展。近年來，利用重組DNA技術(shù)研究開發(fā)的轉(zhuǎn)基因食品快速發(fā)展，有些商品己 經(jīng)被批準(zhǔn)商業(yè)化，并且開始進入普通消費者的餐桌。盡管多數(shù)學(xué)者認(rèn)為轉(zhuǎn)基因食品是安全的， 但在過敏性、毒性、致

14、癌性、食品營養(yǎng)品質(zhì)改變以及環(huán)境等方面，仍存在不少爭議。目前， 對轉(zhuǎn)基因食品各國普遍的態(tài)度是：對相關(guān)食品必須給消費者真實而明確的信息，大多數(shù)國家 要求對轉(zhuǎn)基因食品進行標(biāo)識。挪威是世界上第一個要求對轉(zhuǎn)基因食品進行標(biāo)識的國家，規(guī)定轉(zhuǎn)基因成分的標(biāo)識 限量為2%,歐盟和日本分別為1%和5%。我國政府規(guī)定，但凡列入標(biāo)識管理目錄并用于 銷售的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物，應(yīng)當(dāng)進行標(biāo)識；未標(biāo)識和不按規(guī)定標(biāo)識的，不得進口和銷售。因此 必須對轉(zhuǎn)基因食品進行有效的檢測。從轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立之日起，轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)亦隨之建立。目前主要有兩類轉(zhuǎn)基因 檢測方法：基于特異性DNA片段的PCR檢測技術(shù)和基于特異性蛋白的EuSA(enzyme：

15、一 linked immunosoibent assays)檢測方法。兩種方法的出發(fā)點不同，各有優(yōu)缺點。ELIsA分析法檢 測的特異性蛋白主要是外源目的蛋白和一些報告基因所表達(dá)的蛋白，尤其適用于無需加工的 原料性食品，但對于加工品則有局限性。因為重組基因產(chǎn)物會因加工(特別是高溫)處理而失 活、分解或消失而使檢測的不確定性增加，假陰性率增高。PcR法檢測特異性DNA片段包 括外源啟動于、終止子、報告基因和目的基因。PcR法也不完全適用，因為核酸也會被降解, 但其靈敏度高、適用范圍最廣，目前仍是對轉(zhuǎn)基因食品最常用的檢測方法。轉(zhuǎn)基因食品(GMO, genetically modified organ

16、ism)的PcR檢測分成三個層次：首先 要求檢測出是否含有轉(zhuǎn)入的外源基因，判斷是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，即定性檢測。一旦確定為轉(zhuǎn) 基因產(chǎn)品后，需要進一步明確兩個問題，首先要確定是哪種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，特別是要確認(rèn)是否 為已批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，即要進行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品品系的檢測鑒定；鑒定了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品品系，并 確認(rèn)為己批難的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品后，往往還要檢測出其中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的含后，以明確是否到達(dá)需 標(biāo)識的含量(閾值)，即需要進行定量檢測。目前，對轉(zhuǎn)基因食品的檢測主要有以下幾種PcR方法。1. 定性PCR技術(shù)由于定性PCR所需設(shè)備簡單，試劑也相對廉價，因此是目前轉(zhuǎn)基因檢測中最為常 用的方法之一，一些國家將其作為有關(guān)食品法規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)

17、檢測方法。定性PcR常以啟動子、 終止子、報告基因、目的基因等特異性DNA片段作為檢測目標(biāo)。統(tǒng)計說明，【實時熒光聚合 酶鏈反應(yīng)(PcR)檢沸J技術(shù)CaMv35S啟動子、FM V35S啟動子、Nos終止子、唧£ Ik c,), 3A、Bar和Pat這7種基因片段用做篩查日的靶核酸序列時可覆蓋絕大多數(shù)的GM0品種。 在實際檢測中，可以根據(jù)以上7種基因片段設(shè)計引物和探針進行篩檢。多重PCR經(jīng)過一次 擴增可同時得到多個所需的DNA或基因序列，對于檢測是否含有轉(zhuǎn)基因成分的DNA樣品 明顯減少了反應(yīng)次數(shù)，大大節(jié)省了時間和精力。但由于PcR的高靈敏度己造成假陽性現(xiàn)象, 以及由于操作失誤和一些反應(yīng)抑

18、制因素帶來假陰性現(xiàn)象，各個實驗室間常存在一定誤差，且 不能用于定量分析，使該法具有一定的局限性。2. 競爭定量 PCR 法(quantitative competitive PCR)隨著各國有關(guān)轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)簽法的建立和不斷完善，對GM0的準(zhǔn)確定量檢測變得 口趨重要。一些定量PcR技術(shù)相繼發(fā)展起來。競爭定量PcR就是其中一種。競爭定量PcR 法的原理是采用構(gòu)建的競爭DNA(往往與樣品DNA具有相同的引物結(jié)合序列，但大小相差 一定bp,便于電泳時分開)與樣品DNA在同體系中相互競爭相同的引物和底物，并根據(jù) 電泳結(jié)果做工作曲線，從而得到可靠的定量分析結(jié)果。該法對實驗儀器的要求不高，與定性 PcR相比

19、，降低了抑制因素的影響以及實驗室問的誤差。不足之處是需要用基因重組技術(shù)構(gòu) 建競爭DNA,對一般實驗室來講難度太大，且定量程度難以提高。3. 實時定量 PCR(realtime： PCR)上述這些方法進行檢測時都依賴于各種不同類型的PcR后處理過程，而這些處理 過程很易使數(shù)量巨大的PcR產(chǎn)物飛散到空氣中，使PcR假陽性污染成為可能，尤其是電泳 所用的染色劑EB(漠化乙錠)為強烈致癌物質(zhì)，假設(shè)操作不當(dāng)，會嚴(yán)重危害操作者的健康。另一方面，競爭定量是針對PcR終產(chǎn)物來進行的，而PcR的平臺效應(yīng)在一定程度 上干擾了 PcR的原始模板數(shù)量和終產(chǎn)物之間的相關(guān)性，使定量準(zhǔn)確度難以提高。與這些傳 統(tǒng)方法不同，實

20、時定量PCR方法采用完全閉管檢測，不需PCR后處理，防止了交叉污染。 采用實時監(jiān)測技術(shù)，從檢測開始到定量結(jié)束，整個過程耗時短，操作方便。目前，用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實時定量檢測的RcR儀主要有：(I)ABI公司生產(chǎn)的ABI Prism 5700 型、7700 型、7900HT 型 PcR 儀；(2)Iloch：公司生產(chǎn)的 Light： (ycler-PcR 儀。這兩 種PcR儀既可用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性篩選，也可用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品含量的定量檢測及品系鑒 定。不同的廠家生產(chǎn)的實時定量PcR儀其熒光探針的設(shè)計和熒光信號的監(jiān)測機理不盡 相同。下面以ABI公司生產(chǎn)的ABI Prism系列PcR儀為例說明實時定量Pc

21、R原理。ABI Prism系列熒光定量PcR儀采用的是TaqMan實時熒光PcR技術(shù)，它是在常規(guī) PcR方法基礎(chǔ)上，添加了一條標(biāo)記了 2個熒光基團的探針來檢測PcR產(chǎn)物的數(shù)量。熒光報 告基團(R)標(biāo)記在探針的5' 一端，熒光淬滅基團(Q)標(biāo)記在探針的3' 端，兩者可構(gòu)成能 量傳遞結(jié)構(gòu)，即熒光報告基團所發(fā)出的熒光可被熒光淬滅基團吸收，當(dāng)二者距離變遠(yuǎn)時，抑 制作用減弱，報告基團熒光信號增強。在PcR過程中，TaqMan探針同PcR產(chǎn)物雜交，由于 Taq酶具有5' 到3' 的外切酶活性，在引物延伸階段將TaqMan探針切斷，熒光淬滅 基團(Q)淬滅作用消失，報告基團熒

22、光信號增強。伴隨PcR產(chǎn)物的增加，熒光信號隨之增強, 第n循環(huán)時的熒光信號增加值3R等于Rn / Qn - RO / QO, Rn, RO分別為第n循環(huán)和PcR 反應(yīng)開始時的報告基團熒光值。Qn、Q0分別為第n循環(huán)和PcR反應(yīng)開始時的淬滅基團熒光 值。PcR反應(yīng)的第315個循環(huán)的熒光值作為熒光本底信號，315個循環(huán)的AR。的標(biāo)準(zhǔn) 偏差的1()倍被設(shè)定為熒光閾值(threshold),當(dāng)信號到這該熒光閾值時的循環(huán)次數(shù)(G,值洞 PcR反應(yīng)的初始模板量成正比。通過檢測作物本身所具有的內(nèi)源參照基因(endogenous reference： gene),如玉米醇 溶蛋白(zein)基因、高速泳動蛋白

23、(HMGprote' n)基因、大豆凝集素(led： in)基因，可以測 定樣品中轉(zhuǎn)基因作物和非轉(zhuǎn)基因作物的總DNA模板量；通過檢測轉(zhuǎn)基因作物中轉(zhuǎn)入的外源 基因，如CaMv35S啟動子、CP4 EPSPS基因、c叫LA(6)基因等可以測定樣品中轉(zhuǎn)基因 作物DNA模板量，通過建立轉(zhuǎn)基因作物標(biāo)準(zhǔn)參照樣品的內(nèi)源參照基因與外源基因c,值之 差(:,)與轉(zhuǎn)基因成分百分含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計算出樣品中轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。TaqMan探針技術(shù)巧妙地運用了 PcR技術(shù)的DNA高效擴增、核酸雜交的特異性和 熒光檢測技術(shù)的快速和敏感性，使得本方法具有操作簡單、省時省力、結(jié)果可靠和準(zhǔn)確靈敏 等優(yōu)點。層大脂

24、質(zhì)體。用超聲波法和微量注射法、去垢劑法可獲得單層脂質(zhì)體。4. 突觸體膜的制備制備突觸體膜的基本原理是將腦組織在預(yù)冷的蔗糖溶液中進行勻漿，再利用腦突觸體 膜的蛋白質(zhì)與脂的比例、電荷性質(zhì)、顆粒大小、形狀等不同于其他的細(xì)胞器膜進行蔗糖密度 梯度離心，將其別離出來。二、微粒體的制備微粒體是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞勻漿過程中形成的碎片，并非獨立的細(xì)胞器。由于微粒體 含有代謝外源化合物的混合功能氧化酶，在毒理學(xué)研究中有著重要地位，是較常見的試驗?zāi)?型。制備肝微粒體的方法有超速離心法、鈣沉淀法、凝膠過濾法及等電點沉淀法。基本步驟為：將肝組織勻漿后，2500g離心；棄去沉淀（主要是細(xì)胞核及碎片），取上 清液9000g離心

25、；棄去沉淀（主要是線粒體），取上清液，lOOOOOg離心，得到的沉淀即為線 粒體，上清液為胞漿。所得微粒體用緩沖液懸浮后，貯存在一 20一 70C冰箱中。除超速離心法制備微粒體外，用凝膠過濾、鈣沉淀法和等電點沉淀法也可以制得 微粒體。三、線粒體的制備1. 肝臟線粒體的制備所有操作應(yīng)在低溫條件下進行。全部器械如勻漿器、燒杯、離心管等，以及緩沖 液應(yīng)放4°C冰箱內(nèi)預(yù)冷。2.亞線粒體顆粒的制備亞線粒體顆粒是指經(jīng)特殊處理，除去線粒體外膜和基質(zhì)部分后形成的小囊泡。它含 有氧化磷酸化過程所有的酶類，是觀察呼吸鏈氧化反應(yīng)、ATP酶活性及其他一些特殊反應(yīng)的 模型。亞線粒體顆粒制備的原理是利用超聲波作

26、用，破壞線粒體外膜，再經(jīng)超速離心獲 得僅有內(nèi)膜的亞線粒體顆粒。在超聲處理過程中應(yīng)注意保持線粒體制備物溫度，不要升高， 維持在4°C以下。第二節(jié)核酸的提取與制備核酸的提取是分子生物學(xué)中很重要的基本實驗技術(shù)，也是其他分子生物學(xué)分析方法的 前提條件。核酸樣品的提取質(zhì)量將直接關(guān)系到有關(guān)分析檢測的成敗。別離純化核酸總的原則是應(yīng)保證核酸-級結(jié)構(gòu)的完整性及排除其他分了的污染。為了 保證孩酸結(jié)構(gòu)與功能的研究，完整的一級結(jié)構(gòu)是最基本的要求，因為遺傳信息全部貯存在一 級結(jié)構(gòu)之內(nèi)。核酸的一級結(jié)構(gòu)還決定著其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方 式。經(jīng)純化的核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過

27、高濃度的金屬離子，其他 生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度，此外還要排除其他核酸分 子的污染，如提取DNA分子時，應(yīng)去除RNA分子，反之亦然。為了保證別離核酸的完整性和純度，在實驗過程中應(yīng)注意： 盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞。 減少化學(xué)因素對核酸的降解，為防止過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞, 操作多在DH41（）的條件下進行。 減少物理因素對核酸的降解。物理降解因素主要是機械剪切力，其次是高溫。 機械剪切力包括強力高速的溶液震蕩、攪拌，使溶液快速地通過狹長的孔道，細(xì)胞突然置于 低滲液中，細(xì)胞爆炸式的破裂以及DNA樣品的反復(fù)凍貯。機械

28、剪切作用的主要危害對象是 對分子質(zhì)量大的線性DNA分子，如真核細(xì)胞的染色體DNAo對分子質(zhì)量小的環(huán)狀DNA分 子，如質(zhì)粒DNA及RNA分子，威脅相對小一些。高溫，如長時間的煮沸，除水沸騰帶來 的剪切力外，高溫本身對核酸分子中的有些化學(xué)鍵也有破壞作用。核酸提取過程中，常規(guī)操 作溫度為04C,此溫度環(huán)境可降低核酸酶的活性與反應(yīng)速率，減少對核酸的生物降解。 防止核酸的生物降解。細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 直接破環(huán)核酸的一級結(jié)構(gòu)。其中DNA酶需要金屬二價離子Mg “，ca “的激活，使用金屬 二價離子螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸鹽基木上可以抑制DNA酶的活性。而RNA

29、 酶不但分布廣泛、吸易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿、不易失活，所以生物降解是 RNA提取過程中的主要危害習(xí)素。總的來說，核酸提取的主要步驟就是破碎細(xì)胞，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、 脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除鹽類、有機溶劑等雜質(zhì)， 純化核酸等。核酸提取的方案，應(yīng)根據(jù)具體生物材料和待提取的核酸分子的特點而定。一、DNA的提取與制備從細(xì)胞中提取DNA要用盡可能溫和的細(xì)胞破碎法，以免DNA被機械破碎。操作時還 需要有EDTA的存在，以螯合鎂離子，鎂離子是DNA酶降解DNA所必需的。如果有細(xì)胞 壁，要用酶進行消除，如用溶菌酶處理細(xì)菌，對于細(xì)胞膜要用去污劑溶解。對

30、于不同來源的 細(xì)胞、組織應(yīng)使用不同的裂解液，如果必須使用物理破碎，一定要盡可能地輕緩。細(xì)胞破碎 以及其后的操作都要在4cIC條件下進行，所用的玻璃器皿和溶液都要經(jīng)過高壓滅IS以破壞 DNA 酶。上述方法只適用于細(xì)胞總DNA的提取。不同來源的樣品，處理時有不同的注意事項。 對于新鮮動物組織臟器等提取材料，巾于含有較豐富的DNA酶，應(yīng)迅速冷凍保存?zhèn)溆?，?減少DNA的降解；石蠟包埋組織塊中DNA應(yīng)先進行脫蠟處理；培養(yǎng)細(xì)胞裂解之前應(yīng)用相 應(yīng)的緩沖液進行洗滌；質(zhì)粒DNA提取之前先要經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)，獲得對數(shù)生長后期的細(xì)胞后 進行離心集菌收集，再通過堿性裂解法、去污劑法或煮沸法等進行提取，純化過程也可使用

31、酚/氯仿萃取法，對于小分子DNA(小于10kb),可用渦旋混合器以保證溶液中有機相與水 相混合均勻，當(dāng)純化DNA分子介于1()3Okb時，應(yīng)輕微振蕩，防止DNA被機械剪切，小 于30kh的DNA分子純化時應(yīng)更小心。二、RNA提取與制備RNA提取技術(shù)與上述DNA提取技術(shù)相似。由于RNA分子相對較短，不易被剪切 力損傷，因此細(xì)胞破碎可以用較強有力的方法。RNA對RNA酶敏感，而RNA酣在自然界 廣泛存在，不僅各種細(xì)胞內(nèi)都有RNA酶，操作者的手指上也有RNA酶，因此操作者必須 帶手套，并旦提取液中要有較強的去污劑存在，以便快速滅活RNA酶。接下來的去蛋白操 作須特別強有力，因為RNA常常和蛋白質(zhì)緊密

32、結(jié)合在一起。用DNA酶去除DNA,用乙醇 沉淀RNAo RNA提取要用硫策酸弧.它既是較強的RNA酶抑制劑，又是蛋白變性劑。制 備RNA時所用物品應(yīng)完全無RNA酶。第三節(jié) 基因突變分析與PCR檢測一、基因突變分析基因突變(gene mutation)包括堿基置換、移碼突變和片段突變(參見第五章第二節(jié))。 基因突變是分子水平的變化，在光學(xué)顯微鏡下無法看見，一般是以表型(如生長、生化、形 態(tài)等)的改乏為基礎(chǔ)進行檢測的，也可通過DNA測序、DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)分析(sscP)、基因 差異分析及基因芯片檢測等分子生物學(xué)方法檢測DNA序列的改變來確定。1. PCRSSCP 技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)一一單鏈構(gòu)象多態(tài)

33、性分析 在能夠檢測單個堿基變化的技術(shù)中，單鏈 構(gòu)象多態(tài)性分析因其簡單而有效己成為最常用的技術(shù)。(l) PCRSSCP的基本原理PCRSSCP分析技術(shù)是一種DNA單鏈凝膠電泳技術(shù),它根據(jù)形成不同構(gòu)象的等長DNA 單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測基因變異。首先PCR擴增特定靶序 列，然后將擴增產(chǎn)物變性為單鏈，在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠電泳中電泳。此時， DNA單鏈的遷移率除與DNA鏈的長短有關(guān)外，更主要的是取決于DNA單鏈所形成的構(gòu)象。 在非變性條件下，DNA單鏈可自身折疊形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。這種構(gòu)象由DNA 單鏈的堿基順序決定，其穩(wěn)定性靠分子內(nèi)局部順序的相互作用(主

34、要為氫鍵)來維持。相同長 度的DNA單鏈，其順序不同，甚至單個堿基不同，所形成的構(gòu)象不同，電泳遷移率也不同。 靶DNA中如含單堿基置換或數(shù)個堿基插入、缺失等改變時因遷移率變化會出現(xiàn)泳動變位 (mobility shift)»從而可將發(fā)生突變的DNA與正常DNA區(qū)分開。經(jīng)典的PCR-SSCP技術(shù)采用放射性同位素標(biāo)記引物或核首，再通過放射性自顯影 顯示結(jié)果。但由于放射性同位素的污染及半衰期的問題，限制其推廣應(yīng)用?，F(xiàn)已發(fā)展多種 PCR-SSCP技術(shù)，各有其優(yōu)勢及適用領(lǐng)域。例如，使用熒光素代替核素進行標(biāo)記，也可以 在電泳后用銀染(銀染顯示法也稱冷sscp)。銀染法利用對單鏈DNA親和力較強的

35、特點，大大提高了分辨率 劑檢測的敏感性，且技術(shù)操作簡單、可重復(fù)性好，單鏈帶型清晰，帶與帶之問易于-識別，既 防止了污染，又提高了靈敏性。此外，使用RNA分子來做SSCP會提高其靈敏度，尤其是 對大于20(). b. p的片段檢測更顯優(yōu)勢。RNA分子形成的構(gòu)象穩(wěn)定、種類多，對單堿基置 換等改變敏感，RNA的sscP分析可檢出多條單鏈帶，提高基因變異檢出率，是PCR-SSCP 技術(shù)又i發(fā)展方向。(2) PCRSSCP的優(yōu)缺點PcR-sscP優(yōu)點包括：技術(shù)原理明確，操作簡單，不需特殊儀器，技術(shù)容易掌握： 實驗步驟少、速度快、周期短；檢測靈敏度高，一般無假陽性結(jié)果；可運用于大樣本篩查； 可有效檢測單堿

36、基置換和多堿基插入、缺失等基因突變類型。但PCRSSCP也存在一些不足之處：1) 、該方法最突出的問題是不能檢測出所有的突變，由各實驗室報道的突變檢出 率從35% 99%不等，且分析片段太小，可能呈假陰性結(jié)果。由于隨DNA片段大小的增 加遷移率的改變明顯減少，故該方法只適用于檢測150200bp的DNA片段。一般來說， 小于200bp片段的檢出率可達(dá)90%,而大至400bp的片段，其檢出率只有70%80%,片段 越小，檢出率越高。2) 、SSCP分析影響因素較多。凝膠濃度和交聯(lián)度、電泳溫度、凝膠中甘油的濃度、電 泳緩沖液的離子強度等均可通過影響DNA單鏈構(gòu)象從而影響DNA單鏈的電泳遷移率， 種

37、PcR產(chǎn)物單鏈的良好的電泳條件需要反復(fù)試驗摸索。3) 、PCR-SSCP分析只能發(fā)現(xiàn)是否有突變或堿基序列組成方面的變化，并不能了解 DNA序列變化的性質(zhì)及位點。解決問題的方法是將2知有改變的樣本的PCR產(chǎn)物進行DNA 序列分析.即PCR、SSCP、DNA測序三種方法的聯(lián)用(PCRSSCPDNASequencing技 術(shù))。2. DNA測序基因突變檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”是直接進行DNA測序，一些基因突變篩選方法得出的結(jié) 論往往還需DNA測序來證實。經(jīng)典的DNA測序就其原理來說主要分為化學(xué)降解法和Sanger雙脫氧鏈終止法。在 此基礎(chǔ)上乂發(fā)展了一些基于非放射物質(zhì)標(biāo)記和自動化測序的方法，近年來還發(fā)展了一些

38、全新 的DNA測序方法，如毛細(xì)管凝膠電泳法、陣列毛細(xì)管凝膠電泳法、超薄層凝膠板電泳法等 以及不用電泳別離直接測序技術(shù)，如雜交法、質(zhì)譜法、原子探針法、流動式單分子熒光檢測 法等。(1)化學(xué)降解法1977年.Mao am和Gilb。rt報道了通過化學(xué)降解測定DNA序列的方法，即化學(xué)降 解法(chcm lei。a。gem。thod,也叫M. dxam一Gilbert法)。它的原理是用-些特殊 的化學(xué)試劑處理具末端放射性標(biāo)記的DNA片段，分別作用于DNA序列中4種不同的堿基, 使其在核昔酸序列中形成的糖昔鍵連接變?nèi)?，易從DNA鏈上脫落下來。喪失了堿基的核昔 酸鏈再經(jīng)適當(dāng)處理，就可在缺失堿基處斷裂。在進

39、行這些反應(yīng)時，將反應(yīng)條件控制在每條 DNA鏈斷開一處，因此經(jīng)過處理可產(chǎn)生一系列長短不等的DNA片段。根據(jù)所用的試劑不 同，其末端分別為G, A, C, T,再對一系列這樣的片段進行電泳及放射自顯影，綜合分析, 就可測得DNA分子中的核昔酸排列順序。(2) 酶促雙脫氧鏈終止法酶促雙脫氧鏈終止法又叫Sanger法或鏈終止法(chain termination method)o由于這 種方法要求使用一種單鏈DNA模板和一種合適的DNA合成引物，因此有時也叫引物合成 法或酶催引物合成法。其基本原理是利用了 DNA聚合酶所具有的兩種能催反應(yīng)的特性：第 一，DNA聚合酶能夠利用單鏈的DNA為模板，合成出準(zhǔn)

40、確的DNA互補鏈；第二，DNA 聚合酶能夠利用23' 一雙脫氧核昔三磷酸作底物，使之參與到寡核甘酸鏈的3' 一末端， 從而終止DNA鏈的生長。在同一反應(yīng)管中加入鏈終止劑2' ,3'雙脫氧核昔三磷酸(ddNTP) 中的某一種，以及引物、模板、dNTPs。ddNTP能隨機摻人合成的DNA鏈，一旦摻入，DNA 合成即終止，于是各種不同大小的片段起始端相同，而末端核昔酸必定為該種核昔酸。經(jīng)電 泳及放射自顯影可從圖譜上直接讀出DNA序列。雙脫氧法極適于大規(guī)模測序。(3) 自動化測序法Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam一Gilbert化學(xué)修飾法在DNA測序原理上是公認(rèn)

41、的兩大成就.但兩者也都存在著一些共同的問題有待解決。例如，這兩種方法都需要使用放 射性核素作為標(biāo)記物，盡管靈敏度很高，但存在輻射危害，而旦放射性材料在保藏、處理和 運輸方面也是相當(dāng)麻煩的,再如，這兩種DNA序列分析法都存在著操作步驟繁瑣、效率低、 速度慢等缺點(特別是在結(jié)果的判斷環(huán)節(jié)中)。自DNA序列分析技術(shù)問世不久，為適應(yīng)大規(guī) 模測序的需要，許多科學(xué)家開始致力于DNA分析自動化方面的研究。自動測序儀的原理沿 用Sanger等建立的雙脫氧鏈終止法.DNA聚合酶催化延伸反應(yīng)產(chǎn)生的DNA片段仍需通過 序列膠電泳別離，采用熒光標(biāo)記取代放射性標(biāo)記，通過激光激發(fā)熒光，并與電了電腦程序的 自動化技術(shù)相結(jié)合

42、，到達(dá)自動檢測堿基的目的。而在熒光染料標(biāo)記方式上，美國應(yīng)用生物系 統(tǒng)公司ABI公司(applied biosystem)的自動DNA序列測定儀采用4種熒光基團標(biāo)記，而歐洲 分子生物學(xué)實驗室(EMBL)與瑞典PharmaciaILKB公司聯(lián)手推出的全自動激光序列分析儀 (A. L. F., automated laser fluorescent sequencer)則采用 了單神熒光素標(biāo)記。使用DNA自動測序儀，熟練的操作者一天可以測1000個以上的堿基，而其他測序方 法一般1人1年只能測50 00()個堿基。這種方法因采用電子電腦控制，自動化操作，大大 縮短了測定時間，而且結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是目前

43、最優(yōu)越的測序方法。(4) DNA測序的新方法分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展日新月異，除了上述DNA測序方法，近年來又發(fā)展了一些 全新的DNA測序方法。 以凝膠電泳為基礎(chǔ)的測序方法在傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳的基礎(chǔ)上又發(fā)展了毛細(xì)管電泳激光熒光法、超薄層板 電泳激光熒光法等技術(shù)。毛細(xì)管凝膠電泳比傳統(tǒng)凝膠電泳別離速度提高了 25倍，但1只毛細(xì)管只能別離1 個樣品，因此分析效率并未提高。陣列毛細(xì)管電泳新方法的出現(xiàn)提高了分析效率。1992年, 美國科學(xué)家采用激光聚焦熒光掃描檢測裝置，25只毛細(xì)管并列電泳，每只毛細(xì)管在1. 5h 內(nèi)可讀出35()bp, DNA序列分析效率可到達(dá)6000bp/h° 1994年，

44、日本科學(xué)家提出的另一 種測序裝置，20只毛細(xì)管并列電泳，采用激光熒光電荷耦合陣列檢測器(ccD)檢測，有較高 的靈敏度。采用ccD檢測器，100只毛細(xì)管陣列電泳裝置，可同時檢測100只毛細(xì)管的DNA 別離樣品。使用超薄層凝膠板電泳進行測序，凝膠板厚度僅為50100斗ni,配備流水冷卻 裝置，場強提高到250V/cm,大幅度地提高了電泳速率。而一般的電泳膠厚度為20()400 肛m,電場強度較低(75v / cm),限制了測序的速度。在此基礎(chǔ)上如采用激光熒光ccD檢測 器檢測，則可比常規(guī)電泳測序速度提高9倍，到達(dá)8()0()bp/h以上。 不用電泳別離的洲序新方法DNA測序方法研究的一個熱點是不

45、用電泳別離的技術(shù)。這一類嘗試主要包括：雜交法(sequencing by hybridization, SBH),這是有希望用于快速DNA測序分析 的-種新技術(shù)。它應(yīng)用套巳知序列的寡核昔酸探針，與待測DNA樣品進行雜交，尋找靶 DNA鏈上的互補序列，形成完全互補的雙鏈，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。目前 SBH技術(shù)用于同源序列的比較測定、點突變的檢測已日趨成熟。SBH作為一種快速、自動 化的測序方法，相信未來幾年中會有迅速發(fā)展，在今后的大規(guī)模測序以及分子生物學(xué)和基因 診斷中發(fā)揮重要的作用。質(zhì)譜法中發(fā)展較快的是基體協(xié)助激光解析離子化(MALDI) 一時問飛行質(zhì)譜法用 來檢測雙脫氧循環(huán)產(chǎn)生的D

46、NA片段的序列，相關(guān)的延遲離子抽提技術(shù)(delayed ion exlraclion, DEMALDI),可提高 MALDI 分析精度，還有 MALDI' FOF' DNA 測序方 法。這一類技術(shù)提供了一種新的非凝膠堿基DNA測序方法，最終有可能比傳統(tǒng)的方法學(xué)更 加快速，并為將來的大規(guī)模質(zhì)譜DNA測序提供了可能。原子探針顯微鏡、掃描隧道顯微鏡(sTM)和原子力顯微鏡(AFM)新技術(shù)的發(fā)展， 使快速、高分辨直接觀測DNA分子構(gòu)象成為可能。流動式單分子熒光檢測法也在發(fā)展中。3. 熒光原位雜交原位雜交(ISI, in situ hybr idization),是一種在保持組織、細(xì)胞或

47、染色體原有形態(tài) 結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對其內(nèi)部特殊核昔酸順序進行檢測及定位的分子生物學(xué)手段，可用于染色體 畸變分析。其原理是將己標(biāo)記或經(jīng)特殊修飾的核酸探針與已固定的組織、細(xì)胞或染色體中的 DNA、RNA雜交，繼而通過分析標(biāo)記探針在被檢對象中的顯示狀況而到達(dá)對特殊目標(biāo)順序 進行檢測、定位的目的：用放射性同位素標(biāo)記探針和放射自顯影曾一度作為惟一、高度敏感 的IsH手段。近年來，利用化學(xué)修飾合成核昔酸(如dig-uTP, duTP及ddUTFo等)，并將 這些核苜酸摻入可與被檢目標(biāo)序列雜交的RNA、DNA或寡核昔酸片段中，雜交后通過熒光 法、酶沉淀法或發(fā)色團檢測來鑒定目標(biāo)序列是否存在及其位置。熒光原位雜交(

48、fluorescence in situ hybridization, FIsH)是目前最常用的ISH手段之。(I)熒光原位雜交的原理和特點熒光原位雜交的基本原理為：只要兩個核酸分了的堿基序列互補，就可在適宜條 件下形成穩(wěn)定的雜交分子。FISH就是利用這一原理將標(biāo)記探針同組織、細(xì)胞核或染色體 DNA進行雜交，在下改變其結(jié)構(gòu)和分布格局的情況下進行細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA某特定序列 的測定。FISI-I可用于染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)分析，非整倍體檢測，中期、間期細(xì)胞染色體數(shù)目分 析，微核來源鑒定及精子非整倍睦檢測。熒光原位雜交技術(shù)具有操作及觀察分析簡便、立體 分辨率高、信號明亮清晰以及安全風(fēng)險性小等優(yōu)點。此外，

49、利用不同熒光物質(zhì)所修飾的核昔 酸標(biāo)記不同探針，可在同一樣品中同時識別和分析多個目標(biāo)順序。特別是20世紀(jì)90年代發(fā) 展起來的多色FISH計術(shù)，在同細(xì)胞核或中期染色體中顯示出不同的顏色，從而可同時檢 測2種以上DNA的二維結(jié)構(gòu)，制備出染色體的光譜核型，使全染色體的自動化分析得以實 現(xiàn)，大大拓寬了 FSH的應(yīng)用范圍。而20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的DNAfibre。- FISH,除顯著 提高了 FISH的空間分辨率外，也使FlsH靈敏度進一步提高。（2）熒光原位雜交技術(shù)一般程序一般包括探針制備、組織或細(xì)胞的處理、雜交以及信號的顯示與分析。其流程如 T：DNA探針標(biāo)記（利用化學(xué)修飾合成的核昔酸進行缺口平移、隨

50、機引物或PcR擴增標(biāo) 記）己經(jīng)固定的組織、細(xì)胞或染色體與探針的變性處理D37qC濕盒內(nèi)雜交272h熒光顯微鏡下直接檢測雜交信號（探針上的信號分子可被激發(fā)熒光）以熒光標(biāo)記抗體勺探針信號分子結(jié)合D熒光顯微鏡下觀察雜交信號具體操作步驟包括： 制備和標(biāo)記探針在遺傳毒理學(xué)研究中一般用DNA探針。目前識別畸變的FlsH探針大致可分為染 色體序列探針、由許多DNA大片段組成的全染色體探針和著絲點探針。現(xiàn)在主要通過質(zhì)粒 重組、PcR擴增和人工合成等3種途徑制備探針。常用的探針信號標(biāo)記方法有2種：直接 標(biāo)記法。將熒光分子直接標(biāo)記于探針DNA/RNA上，雜交后可直接在熒光顯微鏡下檢測J, 這種方式快速簡捷，背景干

51、擾很少，但雜交信號較弱，且不能進一步放大，目前己較少采用； 間接標(biāo)記法。采用一個中間分子標(biāo)記探針，雜交后再用生物素或地高辛等熒光分子標(biāo)記的 中間分子的親和物或抗體進行檢測。 染色體原位雜交雜交前變性處理染色體標(biāo)本，使染色體DNA變?yōu)椴糠謫捂?，并去掉附著的RNA及 蛋白質(zhì)，變性處理生物素或地高辛修飾的探針。變性常用加熱或堿變性，變性的溫度和時間 隨探針和組織類型的不同而變化，目的是為了保存組織的完整性和最大的雜交效率。變性后 的探針與變性后的染色體單鏈DNA在適合的溫度、鹽濃度等條件下復(fù)性雜交成雙鏈。此后， 經(jīng)一系列洗滌，將標(biāo)本中未結(jié)合的探針或非特異性雜交的探針全部洗凈。 熒光檢測清洗后的標(biāo)本用

52、熒光標(biāo)記的試劑進行檢測，對生物素標(biāo)記的探針一般用熒光標(biāo)記的 卵白素檢測，而其他中間分子，主要采用熒光標(biāo)記的相應(yīng)抗體來檢測。常用的熒光標(biāo)記分子 有AMCA（藍(lán)光）、異硫敏熒光素（綠光）、羅丹明（紅光）、德州紅（深紅）等。 染色體顯帶通常在雜交后顯帶，如先進行常規(guī)顯帶，再進行FISH會明顯降低雜交信號的檢出率。 常用的顯帶方法包括：Actinomycin/DAPI顯示G帶、經(jīng)浪服嚅嚏處理后再由Hoechest顯 示R帶,或采用Alu或Line重復(fù)序列與探針同時進行雜交，亦可得出顯示G帶或R帶的效 果。 熒光顯微鏡檢測熒光染料受到特定波長的光波激發(fā)便會在其所排布的位置上發(fā)光。此時選擇合適的 濾色鏡，

53、可在同一分裂相上觀察到不同顏色的標(biāo)記物。熒光鏡檢時顯微鏡的質(zhì)量及濾片的選 擇至關(guān)重要，特別是濾片系統(tǒng)，應(yīng)嚴(yán)格按照相應(yīng)熒光分子的熒光激發(fā)/發(fā)射光波長，選擇最 適的激發(fā)/阻擋濾片組合。攝影記錄系統(tǒng)由于固態(tài)電荷耦聯(lián)掃描裝置及圖像分析儀的應(yīng)用， 可以使背景著色很大程度地減低。應(yīng)用激光共貌聚焦顯微鏡，可通過對染色片標(biāo)本的不同平 面進行斷層掃描，并將得到的結(jié)果經(jīng)電腦處理，獲得高質(zhì)量的圖像結(jié)果。4. 基因差異分析分子生物學(xué)的許多雜交、擴增技術(shù)都依賴于特定的探針或引物，才可檢測到基因 改變的情況。而某基因的探針或引物的設(shè)計是在對該基因序列有定了解的前提下進行 的。對于未知序列的分析，此類方法往往無用武之地。各

54、種化學(xué)毒物和環(huán)境危害因素引起的 基因改變或新基因的出現(xiàn)大多是未知的。對于此類基因的分析更多應(yīng)用的是差異分析技術(shù)。目前應(yīng)用較多的是mRNA差異顯示法以及新近發(fā)展的cDNA代表性差異分析法。(1) mRNA差異顯示法IJiang和Pardee等于1992年最早報道了差異顯示法(DDRTPCR, mRNA differential display)o其一般原理是，對mRNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,在此基礎(chǔ)上對每 一類cDNA的PCR選擇性擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，尋找差異片段。該方法主要由以下 三部分組成： 用3'錨定引物對DNA進行逆轉(zhuǎn)錄； 用3,錨定引物及假設(shè)干數(shù)最一定長度的5'

55、隨機引物對逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA進行 PCR擴增，以獲得代表不同mRNA的cDNA片段； 用測序膠別離PCR擴增后的cDNA片段，得出的差異片段在相同條件下再進行 PCR擴增、別離、純化、克隆和測序，即可得到差異片段的序列。差異顯示技術(shù)的不足之處主要是高頻率的假陽性，有時甚至高達(dá)70%以上。為了 消除假陽性，應(yīng)嚴(yán)格設(shè)置對照。Sompayrac(1995)曾提出一些降低假陽性的策略。近兒年來 隨著此項技術(shù)的應(yīng)用日益廣泛，其方法也在不斷改良之中。(2) cDNA代表性差異分析法1994 年 Hubank 等建立 cDNA 代表性差異分析(cDNARDA,cDNA representational di

56、ffer。. Ivo io )。該技術(shù)的基本原理是將差減雜交與PCR有機結(jié)合，利用雙鏈DNA 為模板時可通過PCR呈指數(shù)擴增,而單鏈DNA為模板時呈線性擴增的原理，首先制備cDNA 并用限制性內(nèi)切酶消化成平均長度為256bp的cDNA片段，隨后利用PCR技術(shù)使cDNA片 段得以富集。接著連續(xù)進行3次差減雜交，最后再利用PCR技術(shù)富集特異表達(dá)基因。差減雜交法的工作過程是：從基因表達(dá)特異的組織中提取mRNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 然后與基因無特異表達(dá)的組織中提取的mRNA過量雜交，在基因特異表達(dá)的組織與基因無 特異表達(dá)的組織中均表達(dá)的基因產(chǎn)物形成了 cDNA / mRNA雙鏈雜交分子，而特異mRNA

57、 轉(zhuǎn)錄的cDNA仍保持單鏈狀態(tài)，將這種單鏈cDNA別離出來即為差異表達(dá)的序列。由于。DNA-RDA能發(fā)現(xiàn)與表型相關(guān)的基因異常，并能隨基因表達(dá)的時效性不同 而別離出表達(dá)差異的基因，從而對基因的結(jié)構(gòu)和功能有更多的了解。與mRNA差異顯示法 相比，由于RDA進行了消減雜交，從而大大地減少了 mRNA差異顯示中易于出現(xiàn)的假陽件 結(jié)果。同時，由于消減富集和PCR動力學(xué)富集的特點，可使mRNA差異顯示法中難以顯示 的稀有mRNA的cDNA得以富集并予篩選和克隆。在毒理學(xué)領(lǐng)域，基因差異分析用于尋找外源化合物或環(huán)境誘導(dǎo)基因的研究才剛剛 開始，但由于其在尋找未知新基因方面的獨特優(yōu)勢，必將為分子毒理學(xué)的深入研究做

58、出奉獻(xiàn)。5. 基因芯片檢測基因芯片(gene chip),又稱DNA芯片?；蛐酒夹g(shù)是新近出現(xiàn)的將電腦科學(xué)、核 技術(shù)、物理學(xué)、數(shù)學(xué)等學(xué)科的多種理論和技術(shù)有機結(jié)合而發(fā)展起來的具有劃時代意義的新的 基因分析方法。它將成千上萬個寡核昔酸固定在厘米大小的硅片上，將待測的材料用熒光素 或核素標(biāo)記，在基因芯片上與探針雜交，通過激光共聚焦顯微鏡對芯片進行掃描獲取雜交探 針的熒光信號。其制作方法包括:原位合成法(in situ syonthesis)離片合成法(off chip synthesis) 及大規(guī)模的cDNA微排列?；蛐酒耐怀鎏攸c是可準(zhǔn)確地確定突變位點及突變類型，尤 其是可以同時檢測成千上萬個基因乃至整個基因組的所有突變。它將核酸樣品制備、核酸擴 增和定性定量