1、RNA干擾抑制CD147表達對人胃癌細胞SGC7901增殖、侵襲和順鉑敏感性的影響2010.5.18報告內容l 研究背景l(fā) 研究目標l 實驗方法與結果l 實驗結論一、 研究背景胃癌概況 胃癌最常見的惡性腫瘤之一，惡性腫瘤致死占第二位 。其惡性程度較高，轉移擴散嚴重，多數患者就診時已屬中晚期，因而死亡率較高死亡率較高 。MMP簡介 腫瘤的侵襲和轉移侵襲和轉移是一個復雜的過程，其中細胞外基質和基底膜的降解是腫瘤轉移過程中的重要步驟。這與細胞外基質金屬蛋白酶細胞外基質金屬蛋白酶（extracellular matrix metalloproteinase，MMP）的參與密不可分。 MMP是一個鋅離子

2、依賴的蛋白酶家族，目前已發(fā)現26種。MMP的主要功能是降解細胞外基質降解細胞外基質。腫瘤細胞利用MMP的基質降解能力遷移到其他部位。在腫瘤與間質交界處，MMP往往高表達 。 20世紀80年代，Biswas實驗室從人肺癌細胞株LX-1的細胞膜上分離得到了一種58 kDa的糖蛋白，具有刺激成纖維細胞合成MMP-1的功能，將其命名為腫瘤膠原酶刺激因子腫瘤膠原酶刺激因子（tumor collagenase stimulating factor，TCSF）。 進一步研究表明TCSF不僅能刺激MMP-1的產生，還能刺激MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-11等的產生，因此將其重命名為細胞外基質金屬

3、酶誘導因子細胞外基質金屬酶誘導因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)。 第六屆人類白細胞分化抗原協作組會議將EMMPRIN命名為CD147。CD147的結構 CD147屬單次跨膜糖蛋白，胞外段中的4個半胱氨酸殘基形成2個二硫鍵，構成2個典型的半球形Ig結構域。 細胞內的CD147存在低糖基化低糖基化（ low glycosylated CD147， LG）和高糖基化高糖基化（high glycosylated CD147，HG）形式，分子量分別是3244kDa、4565kDa。只有HG形式能刺激MMP的產生。CD14

4、7的功能 CD147是一種廣泛表達于細胞表面，在體內分布廣泛，參與精子發(fā)生、胚胎發(fā)育、腫瘤的侵襲和轉移腫瘤的侵襲和轉移、炎癥反應、病毒感染等多種生理和病理過程，是一個多功能多功能的分子。 免疫組化實驗證實CD147在多種惡性腫瘤中高表達，包括膀胱癌、皮膚癌、肺癌、乳腺癌、淋巴癌和胰腺癌等。并且腫瘤的惡性程度越高，腫瘤的惡性程度越高，CD147的表達水平也越高。的表達水平也越高。CD147在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用 1. 促進腫瘤的侵襲和轉移促進腫瘤的侵襲和轉移 CD147就是通過刺激成纖維細胞及腫瘤細胞本身產生多種MMP來降解基底膜和細胞外基質，從而促進腫瘤的浸潤和轉移的。 2. 誘導腫瘤血管生成

5、誘導腫瘤血管生成 血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor ， VEGF）是很多情況下血管生成過程的主要調節(jié)因子，包括腫瘤形成過程 。CD147可以誘導可以誘導VEGF的表達的表達。 3. 促進腫瘤細胞多藥耐藥促進腫瘤細胞多藥耐藥 在多種多藥耐藥多藥耐藥的腫瘤細胞中都觀察到CD147的高表達。CD147可激活PI3K/AKT細胞存活信號通路。在大多數惡性腫瘤細胞中此通路均被激活。胃癌中CD147的表達 日本Toyama大學的Zheng HC等研究表明：在正常胃黏膜正常胃黏膜發(fā)展為增增生性或化生性胃黏膜生性或化生性胃黏膜，最后發(fā)展為胃癌胃癌的過程中，

6、CD147的表達量是逐漸增加的，并且CD147的表達與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結轉移以及MMP-2、MMP-9和VEGF的表達呈正相關。 胃癌組織中CD147的表達CD147在胃癌組織中高表達在胃癌組織中高表達二. 研究目標 本實驗旨在運用RNA干擾技術抑制胃癌細胞株SGC7901中CD147基因的表達，研究該基因沉默后對腫瘤細胞生長、侵襲能力及化療藥物敏感性的影響，探討CD147在胃癌中的作用。三、研究方法及結果CD147shRNA真核表達載體的構建與鑒定轉染SGC7901細胞，篩選穩(wěn)定表達干擾載體的SGC7901細胞株MTT法檢測SGC7901細胞增殖水平的變化明膠酶譜法檢測SGC7901

7、細胞MMP-2、MMP-9分泌的變化SGC7901細胞體外侵襲力測定MTT檢測SGC7901細胞順鉑敏感性的變化技術路線技術路線技技 術術 路路 線線 胃癌細胞株SGC7901源自一位56歲女性胃腺癌患者的淋巴結轉移瘤。研究表明其侵襲能力強，惡性程度高。我們前期研究表明，該細胞表面CD147是高表達的是高表達的。 shRNA（short hairpin RNA）表達載體的構建pSilencer3.1-H1 neoshRNA模板的設計示意圖干擾靶序列的選擇 參考陳翔等的報道，選取CD147mRNA 370-390和808-828作為靶序列，相應的shRNA分別命名為shRNA1和shRNA2。另

8、外，設計一個陰性對照shRNA-control。RNAi靶序列在CD147 mRNA上的位置 1 AGCGGTTGGA GGTTGTAGGA CCGGCGAGGA ATAGGAATCA TGGCGGCTGC 51 GCTGTTCGTG CTGCTGGGAT TCGCGCTGCT GGGCACCCAC GGAGCCTCCG 101 GGGCTGCCGG CACAGTCTTC ACTACCGTAG AAGACCTTGG CTCCAAGATA 151 CTCCTCACCT GCTCCTTGAA TGACAGCGCC ACAGAGGTCA CAGGGCACCG 201 CTGGCTGAAG GGGGG

9、CGTGG TGCTGAAGGA GGACGCGCTG CCCGGCCAGA 251 AAACGGAGTT CAAGGTGGAC TCCGACGACC AGTGGGGAGA GTACTCCTGC301 GTCTTCCTCC CCGAGCCCAT GGGCACGGCC AACATCCAGC TCCACGGGCC351 TCCCAGAGTG AAGGCTGTG GAGGGGGAGA 401 CGGCCATGCT GGTCTGCAAG TCAGAGTCCG TGCCACCTGT CACTGACTGG 451 GCCTGGTACA AGATCACTGA CTCTGAGGAC AAGGCCCTCA TG

10、AACGGCTC 501 CGAGAGCAGG TTCTTCGTGA GTTCCTCGCA GGGCCGGTCA GAGCTACACA 551 TTGAGAACCT GAACATGGAG GCCGACCCCG GCCAGTACCG GTGCAACGGC601 ACCAGCTCCA AGGGCTCCGA CCAGGCCATC ATCACGCTCC GCGTGCGCAG 651 CCACCTGGCC GCCCTCTGGC CCCTCCTGGG CATCGTGGCT GAGGTGCTGG 701 TGCTGGTCAC CATCATCTTC ATCTACGAGA AGCGCCGGAA GCCCGAGG

11、AC 751 GTCCTGGATG ATGACGACGC CGGCTCTGCA CCCCTGAAGA GCAGCGGGCA801 GCACCAG CCAGAGGAAC TCTTCCTGAG 851 GCAGGTGGCC CGAGGACGCT CCCTGCTCCA CGTCTGCGCC GCCGCCGGAG901 TCCACTCCCA GTGCTTGCAA GATTCCAAGT TCTCACCTCT TAAAGAAAAC 951 CCACCCCGTA GATTCCCATC AT設計好的shRNA插入序列2、CD147 shRNA表達載體的構建： 將合成的三對片段分別用水浴中加熱后退火備用，與經B

12、amH I和Hind III雙酶切的pSilencer3.1-neo質粒連接，構建成CD147 shRNA表達載體，重組質粒分別命名為pSilencer-shRNA1， pSilencer-shRNA2 和pSilencer-shRNA-control 。重組質粒測序鑒定結果DNA測序表明，測序表明，3個重組質粒構建個重組質粒構建正確。正確。pSilencer/shRNA1測序圖（紅線為插入片段）轉染及篩選 脂質體轉染48h后用含0.4g/ml的G418的完全培養(yǎng)基篩選2周，然后改為半量維持。將抗G418的陽性細胞克隆用有限稀釋法分離出來并逐步擴增以待進一步分析。篩選出的細胞克隆分別命名為SG

13、C7901/shRNA1，SGC7901/shRNA2和SGC7901/shRNA-control。Real-time PCR檢測CD147 mRNA表達水平 與SGC7901相比，SGC7901/shRNA1和SGC7901/shRNA2細胞中CD147 mRNA相對表達量分別下降至72.4%和和17.3% 。 1 2 3 4HGLGCD147-actinLane 1: SGC7901.Lane 2: SGC7901/shRNA-controlLane 3: SGC7901/shRNA1Lane 4: SGC7901/shRNA2 HG代表高糖基化形式的CD147，LG代表低糖基化形式的CD

14、147。Western blot結果與結果與Real-time PCR結果相符。結果相符。接種細胞接種細胞 培養(yǎng)細胞培養(yǎng)細胞 加入加入MTT呈色呈色 終止培養(yǎng)終止培養(yǎng) 比色比色 結果計算結果計算 抑制率抑制率(%)=(對照組對照組A 值值-實驗組實驗組A 值值)對照組對照組A 值值100% 24h、48h、72h 時間點時間點MTT細胞增殖實驗 與SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，培養(yǎng)24h、48h、72h后S G C 7 9 0 1 /s h R N A 2 細 胞 增 殖 能 力 均 顯 著 降 低細 胞 增 殖 能 力 均 顯 著 降 低 . 而 陰 性 對

15、 照 組SGC7901/shRNA-control增殖能力無顯著改變。明膠酶譜法檢測細胞上清中MMP-2和MMP-9的活性 明膠酶包括72 kDa的明膠酶A（基質金屬蛋白酶-2，MMP-2）和92 kDa的明膠酶B (基質金屬蛋白酶-9，MMP-9)。其作用底物為基底膜中的型膠原和變性的間質膠原（明膠變性的間質膠原（明膠），），其活性與腫瘤細胞侵襲和轉移能力密切相關。 明膠酶譜法是一種測定明膠酶活性的常用方法。收集細胞培養(yǎng)上清液，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法可將這兩種明膠酶按分子量大小分開，顯示兩條負染條帶，根據條帶的面積和亮度可判定明膠酶的活性。明膠酶譜結果MMP-2MMP-9 1 2 3

16、Lane 1:SGC7901. Lane 2:SGC7901/shRNA-control.Lane 3:SGC7901/shRNA2*BSGC7901/shRNA2細胞上清液中細胞上清液中MMP-2和和MMP-9的活性明顯降低的活性明顯降低 Transwell原理 Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質成分，含有層粘連蛋白、型膠原等。將Matrigel鋪在Transwell侵襲小室的多孔濾膜上，能形成與天然基底膜極為相似的基底膜結構。Transwell結果穿過穿過Transfer侵襲小室的染成紫色的細侵襲小室的染成紫色的細胞（胞（400）SGC7901SGC7901/shRNA-con

17、trolSGC7901/shRNA2SGC7901/shRNA2細胞細胞 體外侵襲能力顯體外侵襲能力顯著降低著降低B*順鉑敏感性實驗 抗腫瘤藥物順鉑的使用濃度以血漿峰濃度（ Peak Plasma Concentration，PPC) 為標準。參照Sondak等的報道，順鉑的PPC為3.0 g/ml。 本實驗中使用的順鉑濃度為：0.01PPC，0.1PPC，10PPC。細胞生長抑制率（%）=1-OD(cisplatin）/OD(cisplatin) 100% 與與SGC7901和和SGC7901/shRNA-cont rol相 比 ， 順 鉑 對相 比 ， 順 鉑 對SGC7901/shRNA2的抑制率顯著增加的抑制率顯著增加*四、實驗結論l 成功構建了靶向CD147的shRNA真核表達載體；l 成功轉染了人胃癌細胞SGC7901，并獲得了穩(wěn)轉細胞株，經Real-time PCR、Western Blot檢測，CD147在mRNA和蛋白水平均被顯著抑制；l CD147表達沉默后S