1、臍血造血干細(xì)胞短時(shí)間凍存效果驗(yàn)證 摘要 為了驗(yàn)證臍血造血干細(xì)胞短時(shí)間凍存的有效性，使用羥乙基淀粉沉降去除臍血中的紅細(xì)胞，淋巴細(xì)胞分離液獲取臍血單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測定CD34+細(xì)胞純度，從而獲得將含有HSC的臍血單個(gè)核細(xì)胞用凍存液懸起，并將單個(gè)核細(xì)胞以2×107個(gè)ml的凍存密度凍存在2ml凍存管中，立即放入裝有異丙醇的程序降溫盒中，并將凍存盒放入-80冰箱中進(jìn)行程序降溫，五小時(shí)后轉(zhuǎn)入液氮凍存。分別在凍存1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月進(jìn)行復(fù)蘇，并做臺(tái)盼藍(lán)活率檢測、流式細(xì)胞儀測定CD34+細(xì)胞純度。結(jié)果: 三個(gè)月內(nèi)細(xì)胞復(fù)蘇率和臺(tái)盼藍(lán)活率檢測沒有顯著變化，液氮可以有效地短時(shí)間凍存臍血造血干細(xì)胞。

2、關(guān)鍵詞：臍血；造血干細(xì)胞；凍存；復(fù)蘇Umbilical cord blood hematopoietic stem cells cryopreserved short time effect validationAbstractIn order to verify the effectiveness of cryopreserved cord blood hematopoietic stem cells for short periods of time, remove the red blood cells in the umbilical cord blood, using hydroxy

3、ethyl starch subsidence Methods: hydroxyethyl starch subsidence, remove the red blood cells in the umbilical cord blood lymphocyte separation medium for umbilical cord blood mononuclear cells, flow cytometry instrument determination of purity of CD34 + cells. To using umbilical cord blood mononuclea

4、r cells of freeze-stored liquid suspension, and mononuclear cells to 2 x 107 / ml of frozen storage density frozen tube in 2 ml of cryopreserved, immediately into the program with isopropyl alcohol and cooling box, and the frozen deposit box in the - 80 programs to cool in the refrigerator, after fi

5、ve hours into liquid nitrogen frozen storage. In cryopreserved 1 month, 2 months, 3 months for recovery, and trypan blue live rate detection, flow cytometry instrument determination of purity of CD34 + cells. Results: Three months cell recovery rate did not change significantly and trypan blue live

6、rate detection, liquid nitrogen cryopreserved cord blood hematopoietic stem cells can be effectively for short periods of time. Key words: umbilical cord blood; Hematopoietic stem cell; Frozen storage; recovery 前言臍帶血及臍血單個(gè)核細(xì)胞（cord blood mononuclear cells,CB-MNC ）：臍帶血是胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液，通常是廢棄不用

7、的。近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)，臍帶血中含有大量的臍血單個(gè)核細(xì)胞，臍帶血MNC中含有可以重建人體造血和免疫系統(tǒng)的造血干細(xì)胞，可用于造血干細(xì)胞移植，治療多種疾病。因此，臍帶血MNC已成為造血干細(xì)胞的重要來源，特別是無血緣關(guān)系造血干細(xì)胞的來源。也是一種非常重要的人類生物資源。臍血造血干細(xì)胞(Cord blood hematopoietic stem cells,CB-HSC)：CD34是最常用的分離造血干細(xì)胞的標(biāo)志。CD34+干細(xì)胞主要存在于骨髓和臍帶血中，因其具有自我更新、多種分化能力和廣闊的應(yīng)用前景而備受關(guān)注1臍血移植(cord blood transplantation，CBT)近年來在國內(nèi)外得到迅

8、速發(fā)展，臨床實(shí)踐表明CBT是治療白血病、惡性淋巴瘤及重型海洋性貧血等多種疾病的有效方法2。由于臍血來源充足，采集方便，對(duì)母親及胎兒無危害，HLA配型要求不高，臍血中含有豐富的造血干細(xì)胞及免疫活性細(xì)胞，臍血已經(jīng)成為骨髓造血干細(xì)胞的重要補(bǔ)充，尤其在兒童惡性血液病的治療中，臍血移植大有取代骨髓移植之勢。同時(shí)，臍血移植也暴露出一些嚴(yán)重問題，如單份臍血中造血干細(xì)胞的數(shù)量有限，植入率偏低，平均約72，移植后造血及免疫功能恢復(fù)緩慢，由此造成的早期移植相關(guān)死亡率偏高3，平均約20。如何有效利用數(shù)量有限的造血干細(xì)胞，臍血的冷凍保存技術(shù)一直備受關(guān)注。本文通過單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)、臺(tái)盼藍(lán)拒染率及CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)等指標(biāo)，

9、探討短時(shí)間凍存臍血造血干細(xì)胞有效性，為臍血造血干細(xì)胞深低溫長時(shí)間凍存和臍血移植的臨床應(yīng)用提供參考。凍存過程中影響臍血干細(xì)胞復(fù)蘇后各種性能的因素很多，比如：冷凍速率、凍存時(shí)間、冷凍保護(hù)劑的選擇、以及復(fù)蘇的程序等等4。程控降溫是臍帶血造血干細(xì)胞冷凍最常采用的方法。本實(shí)驗(yàn)操作按常規(guī)程控降溫系統(tǒng)凍存臍血造血干細(xì)胞，立即將裝有臍血造血干細(xì)胞的凍存管放到裝有異丙醇的程序降溫盒中，使凍存管細(xì)胞懸液溫度下降速率保持1/min，是較為理想的降溫過程5。凍存液（4冰箱中保存）組成：90%自身臍血血清+10%DMSO 6一、研究方法1、實(shí)驗(yàn)材料1.1、主要儀器：倒置顯微鏡(Olympus)、流式細(xì)胞儀(EliteE

10、SP美國Beckman Immunotech公司產(chǎn)品)、低速臺(tái)式離心機(jī)（北京北利DT5-2）、-80超低溫冰箱（日本三洋）、液氮、電子分析天平1.2、主要試劑：PE-CD34單抗（美國BD公司）、淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)?、羥乙基淀粉（賀斯，北京費(fèi)森尤斯卡比）、生理鹽水、臺(tái)盼藍(lán)、DMSO(sigma)1.3、主要試劑的配制：、4%臺(tái)盼藍(lán)母液：用電子分析天平稱取4g臺(tái)盼藍(lán)，加少量三蒸水研磨，并用三蒸水配制成100ml，濾紙過濾，4度保存。使用時(shí)，用PBS稀釋至0.4%。染色終濃度為0.04%7、凍存液（4冰箱中保存）配制：90%自身臍血血清+10%DMSO 2、實(shí)驗(yàn)方法2.1、臍血采集9份臍血標(biāo)

11、本均來自醫(yī)院婦產(chǎn)科出生的胎兒。要求產(chǎn)婦年齡35歲，妊娠3442周，營養(yǎng)、發(fā)育正常，無惡性腫瘤及各種遺傳性疾病，無乙肝、丙肝、梅毒等急慢性傳染病，妊娠期內(nèi)無嚴(yán)重合并癥。胎兒娩出斷臍后，即從臍靜脈穿刺抽取臍血注入含有肝素抗凝劑三聯(lián)袋中備檢。2.2、羥乙基淀粉（HES）沉降法去除臍血中的紅細(xì)胞。6%HES按1：4與含有肝素抗凝劑的臍血混合8，靜置40min，取上清液。2.3、臍血單個(gè)核細(xì)胞分離：采用淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）分離臍血中的單個(gè)核細(xì)胞(MNC)。在50 mL離心管中加入25 mL Ficol1分離液，緩慢加入等量的去除紅細(xì)胞的臍血上清液，2000r/min 20離心20min，吸取白

12、細(xì)胞層，用50ml生理鹽水懸起細(xì)胞，混勻，取2ml細(xì)胞懸液于EP管中用于細(xì)胞計(jì)數(shù)、臺(tái)盼藍(lán)活率檢測和CD34+細(xì)胞純度測定。2000rmin離心20min，離心后棄掉上清。2.4、90%自身臍血血清+10%DMSO 作為細(xì)胞冷凍保護(hù)劑。用冷凍保護(hù)劑重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×107個(gè)ml，裝入2ml凍存管中，立即放入裝有異丙醇的程序降溫盒中，并將凍存盒放入-80冰箱中進(jìn)行程序降溫，五小時(shí)后轉(zhuǎn)入液氮凍存。分別凍存1、2及3個(gè)月后，每次取出3份標(biāo)本（第一個(gè)月取編號(hào)13、第二個(gè)月取編號(hào)46、第三個(gè)月取編號(hào)79）放入37水浴箱中快速復(fù)蘇9。2.5、檢測指標(biāo)用臺(tái)盼藍(lán)拒染法顯微鏡下計(jì)算單個(gè)核細(xì)胞活

13、率，用流式細(xì)胞儀檢測CD34+細(xì)胞純度。CD34單抗購自美國BD公司，為小鼠IgG型抗人抗體。每個(gè)樣本用FITC標(biāo)記同型IgG作為陰性對(duì)照，直接免疫熒光標(biāo)記法標(biāo)記細(xì)胞表面抗原，按前散射側(cè)散射圈定淋巴細(xì)胞群，以流式細(xì)胞儀配套軟件(Elite 45版本)分析樣本中10×106個(gè)細(xì)胞的標(biāo)記陽性表達(dá)率。3、數(shù)據(jù)處理和分析3.1、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示，各組間先采用F檢驗(yàn)比較，然后采用t檢驗(yàn)。 P<005認(rèn)為兩總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即兩總體存在顯著性差異。4、結(jié)果9份臍帶血的平均采集量為(9242±1688)mL，平均MNC為(2.1

14、9±0.44)×108 ，流式細(xì)胞儀測定CD34+細(xì)胞平均純度為（2.58±0.25）%。經(jīng)在-196液氮凍存1、2、3個(gè)月后，取出標(biāo)本放入37水浴箱中快速復(fù)蘇。三個(gè)月臍血單個(gè)核細(xì)胞復(fù)蘇率、CD34+細(xì)胞（HSC）復(fù)蘇率及臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞率進(jìn)行對(duì)比，均無顯著差異。二、結(jié)果分析與討論 表1：MNC凍存前后細(xì)胞計(jì)數(shù)（n×108） 凍存一個(gè)月 凍存兩個(gè)月 凍存三個(gè)月MNC凍存前細(xì)胞計(jì)數(shù) 2.31+0.20 2.16+0.72 2.11+0.43MNC凍存后細(xì)胞計(jì)數(shù) 1.77+0.25 1.68+0.70 1.54+0.40 表2：MNC復(fù)蘇率 編號(hào)13 編號(hào)46

15、編號(hào)79MNC復(fù)蘇率 0.81、0.76、0.72 0.83、0.75、0.71 0.77、0.72、0.69MNC凍存一個(gè)月進(jìn)行復(fù)蘇，細(xì)胞平均復(fù)蘇率為：76.6%；MNC凍存兩個(gè)月進(jìn)行復(fù)蘇，細(xì)胞平均復(fù)蘇率為：77.8 %；MNC凍存三個(gè)月進(jìn)行復(fù)蘇，細(xì)胞平均復(fù)蘇率為：73.0 % ；MNC凍存一個(gè)月后復(fù)蘇結(jié)果和凍存兩個(gè)月后復(fù)蘇結(jié)果不存在顯著差異（F=1.84 F表 T=0 F0.05）；MNC凍存兩個(gè)月后復(fù)蘇結(jié)果和凍存三個(gè)月后復(fù)蘇結(jié)果不存在顯著差異（F=2.28F表 T=1.049 F0.05）；MNC凍存一個(gè)月后復(fù)蘇結(jié)果和凍存三個(gè)月后復(fù)蘇結(jié)果不存在顯著差異（F=1.24F表 T=1.049

16、F0.05）。說明短時(shí)間凍存不會(huì)影響凍存后復(fù)蘇結(jié)果。由于細(xì)胞掛壁率較高，導(dǎo)致凍存后復(fù)蘇率較小，所以適當(dāng)調(diào)節(jié)凍存密度有助于提高凍存后細(xì)胞復(fù)蘇率。（表1、表2） 表3：HSC凍存前細(xì)胞計(jì)數(shù)（n×106） 凍存一個(gè)月 凍存兩個(gè)月 凍存三個(gè)月HSC凍存前細(xì)胞計(jì)數(shù) 6.30+0.80 5.54+2.71 5.28+1.69HSC凍存后細(xì)胞計(jì)數(shù) 4.20+0.87 3.74+2.01 3.37+1.31HSC凍存一個(gè)月進(jìn)行復(fù)蘇，凍存前細(xì)胞計(jì)數(shù)為：6.30+0.80，凍存后細(xì)胞計(jì)數(shù)為：4.20+0.87，細(xì)胞平均復(fù)蘇率為：66.7%；HSC凍存兩個(gè)月進(jìn)行復(fù)蘇，凍存前細(xì)胞計(jì)數(shù)為：5.54+2.71，

17、凍存后細(xì)胞計(jì)數(shù)為：3.74+2.01 ，細(xì)胞平均復(fù)蘇率為：67.5%；HSC凍存三個(gè)月進(jìn)行復(fù)蘇，凍存前細(xì)胞計(jì)數(shù)為：5.28+1.69，凍存后細(xì)胞計(jì)數(shù)為：3.37+1.31，細(xì)胞平均復(fù)蘇率為：63.8% HSC復(fù)蘇率與文獻(xiàn)6上數(shù)據(jù)無顯著差異。HSC凍存一個(gè)月后復(fù)蘇結(jié)果和凍存兩個(gè)月后復(fù)蘇結(jié)果不存在顯著差異（F=1.84 F表 T=0 F0.05）；HSC凍存兩個(gè)月后復(fù)蘇結(jié)果和凍存三個(gè)月后復(fù)蘇結(jié)果不存在顯著差異（F=2.28F表 T=1.049 F0.05）；HSC凍存一個(gè)月后復(fù)蘇結(jié)果和凍存三個(gè)月后復(fù)蘇結(jié)果不存在顯著差異（F=1.24F表 T=1.049 F0.05）。說明HSC于液氮中短時(shí)間凍存不

18、會(huì)影響凍存后復(fù)蘇結(jié)果。（注：HSC細(xì)胞數(shù)=MNC細(xì)胞數(shù)×CD34+純度×MNC細(xì)胞活率）（表3） 表4：臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞活率檢測 凍存一個(gè)月 凍存兩個(gè)月 凍存三個(gè)月MNC凍存前臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞活率 99.7% 98.5% 98.7% MNC凍存后臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞活率 86.4% 85.8% 85.6%MNC凍存后與凍存前細(xì)胞活率有所下降，分析主要原因有兩點(diǎn)：（1）、細(xì)胞超低溫保存，使部分細(xì)胞內(nèi)部水分凝固形成較大的冰晶，而直接導(dǎo)致細(xì)胞破碎、裂解，使得細(xì)胞的復(fù)蘇率和細(xì)胞活率顯著降低。（2）、凍存液中的DMSO對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，有實(shí)驗(yàn)表明 ,1 %以上濃度的 DMSO 對(duì)細(xì)胞有毒性。Rubins

19、tein 等10，影響細(xì)胞活率。隨著凍存時(shí)間的推移，細(xì)胞活率一直在下降，但是下降不明顯，三個(gè)月內(nèi)活率檢測不存在顯著差異。三、結(jié)論凍存復(fù)蘇后HSC復(fù)蘇率分別為66.7%、67.5%、63.8% 三個(gè)月內(nèi)細(xì)胞復(fù)蘇率和臺(tái)盼藍(lán)活率檢測沒有明顯變化，液氮可以有效地短時(shí)間凍存臍血造血干細(xì)胞。參考文獻(xiàn)：1姚志娟，烏仁娜，畢東杰，等.臍血CD34+細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為T淋巴細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究J.中國免疫學(xué)雜志，2003，19(12)：841-844.2任漢云。臍血移植臨床評(píng)價(jià)和主要問題探討。中華血液學(xué)雜志2006；27（11）：791-7923鄧雪蓉，任漢云等。100例異基因造血干細(xì)胞移植后移植物抗宿主病的發(fā)生及其對(duì)患者復(fù)發(fā)和生存的影響。中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志2009；17：994-9984 Harris D T，Schumacher M J，Ryehlik S et Colection，separationand cryopreservation ofumbilical eord bloodfor use intransplantationBoneMarrow Transplant，1994，13：135 1435 沈華萍等：不同降溫速率對(duì)臍血干細(xì)胞冷凍復(fù)蘇后生物學(xué)特性的影響。生物工程學(xué)報(bào)2003年