1、二維電泳應用于糖蛋白的分離鑒定二維電泳應用于糖蛋白的分離鑒定目 錄糖蛋白1糖基化2凝膠電泳分離純化技術3基于PAS反應的染色方法4由短的寡糖鏈與蛋白質(zhì)共價結合構成的分子。蛋白質(zhì)含量較多，糖所占比例變動大，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)的特性。細胞膜、溶酶體、細胞外液糖蛋白glycoprotein ）膜蛋白中的糖膜蛋白分子中的糖這些寡糖鏈常常是具分支的雜糖鏈，不呈現(xiàn)重復的雙糖系列，一般由2-10個單體少于15組成，未端成員常常是唾液酸或L-巖藻糖。 糖蛋白的結構單糖的種類葡萄糖(Glu)半乳糖(Gal)甘露糖(Man)N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)巖藻糖(Fuc)N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)N-乙酰神經(jīng)氨酸

2、(NeuAc)連接方式N-銜接：O-銜接：糖蛋白的結構糖基化糖基化糖基化 是蛋白質(zhì)翻譯后修飾最重是蛋白質(zhì)翻譯后修飾最重要的方式之要的方式之一，是必需的生理過程，對蛋白質(zhì)一，是必需的生理過程，對蛋白質(zhì)生物學功能的生物學功能的正確發(fā)揮起著至關重要的作用。正確發(fā)揮起著至關重要的作用。糖蛋白的形成是糖基化的一種表現(xiàn)糖蛋白的形成是糖基化的一種表現(xiàn)形式形式糖基化生物活性折疊溶解度半衰期抗原性蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)糖鏈糖鏈糖蛋白 分離純化及鑒定是糖蛋白研究分離純化及鑒定是糖蛋白研究的重要步驟的重要步驟糖蛋白的分離純化方法Capillary electrophoresisCapillary electrophoresi

3、s毛細管電泳毛細管電泳MLCMLC多維液相色譜多維液相色譜electroblottillg電印跡技術gelelectrophoresis凝膠電泳電泳技術的基本原理等電聚焦(Isoelectro focusing IEF)等電聚焦(Isoelectro focusing IEF)等電聚焦(Isoelectro focusing IEF)插入梳子插入梳子加緩沖液加緩沖液加加 樣樣電泳電泳剝膠剝膠凝膠電泳可直接在膠上對糖蛋白進行酸水解或酶解后進行后續(xù)的鑒定分析或糖鏈的結構分析?？梢酝瑫r分離多個復雜混合物優(yōu)勢優(yōu)勢雙向凝膠電泳二維電泳）雙向凝膠電泳二維電泳） 第一向采用等電聚焦第一向采用等電聚焦 根據(jù)復

4、雜的蛋白質(zhì)成根據(jù)復雜的蛋白質(zhì)成分中各個蛋白質(zhì)的分中各個蛋白質(zhì)的PIPI的不同，將蛋白質(zhì)進行分離。的不同，將蛋白質(zhì)進行分離。 第二向采用了十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺第二向采用了十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳 （SDS-PAGESDS-PAGE就是按蛋白質(zhì)分子量的大就是按蛋白質(zhì)分子量的大小使其在垂直方向進行分離。其結果不再是條帶小使其在垂直方向進行分離。其結果不再是條帶狀，而是呈現(xiàn)為斑點狀狀，而是呈現(xiàn)為斑點狀 。二維電泳膠性 PH9中電加解入質(zhì)了溶雙液 PH3加上電場后建立穩(wěn)定PH梯度蛋白質(zhì)溶液加入，建立電場染色后，蛋白質(zhì)因PI值不同，沿PH梯度分離開第一向等電聚焦PI逐漸降低等電聚焦

5、膠放在SDS聚丙烯酰胺凝膠上 第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量逐漸降低PI 逐漸降低 雙向凝膠電泳示意圖雙向凝膠電泳示意圖二維電泳二維電泳1基于PAS反應的染色方法3GelCode糖蛋白染色試劑盒2硼酸根熒光染料二維電泳中糖蛋白的染色方法基于PAS反應的染色方法PAS-periodic acid-Schiffs base method(高碘酸/過碘酸-席夫式堿方法)原理 在過碘酸的作用下，糖蛋白中糖鏈上相鄰兩個碳原子上的羥基被氧化成醛基，醛基再與帶有紫外或熒光基團的氨基形成席夫式堿，在紫外或熒光燈下檢測即可。席夫式堿N原子和C原子雙鍵結合的一類化合物基于PAS反應的染色方法酸性品紅丹酰肼熒光試劑丹磺酰甘氨酰肼熒光試劑Pro-Q Emerald類染料過碘酸作用顯紫紅色對還有唾液酸的糖蛋白靈敏染色7天靈敏度低g高碘酸作用醛基與胺基反應形成腙染色2天靈敏度低40 ng反應條件苛刻酸性條件靈敏度低10-