1、真核生物的啟動子有其特殊性，真核生物有三種真核生物的啟動子有其特殊性，真核生物有三種RNA聚合酶，每一種聚合酶，每一種都有本人的啟動子類型。以都有本人的啟動子類型。以RNA聚合酶聚合酶的啟動子構(gòu)造為例，人們比的啟動子構(gòu)造為例，人們比較了上百個真核生物較了上百個真核生物RNA聚合酶聚合酶的啟動子核苷酸序列伯發(fā)現(xiàn)；在的啟動子核苷酸序列伯發(fā)現(xiàn)；在-25區(qū)有區(qū)有TATA框，又稱為框，又稱為Hogness框或框或Goldberg-Hogness框。其一框。其一致序列為致序列為T28A97A93A85A63T37A83A50T37，根本上都由，根本上都由A，T堿基堿基所組成，實驗闡明，所組成，實驗闡明，T

2、ATA框決議了轉(zhuǎn)錄起點的選擇，天然短少框決議了轉(zhuǎn)錄起點的選擇，天然短少TATA框的根本可以從一個以上的位點開場轉(zhuǎn)錄。在框的根本可以從一個以上的位點開場轉(zhuǎn)錄。在-75區(qū)有區(qū)有CAAT框，其一框，其一致的序列為致的序列為GGTCAATCT。有實驗闡明。有實驗闡明CAAT框與轉(zhuǎn)錄起始頻率有關(guān)?？蚺c轉(zhuǎn)錄起始頻率有關(guān)。三原核基因轉(zhuǎn)錄的起始三原核基因轉(zhuǎn)錄的起始原核生物轉(zhuǎn)錄起始可分為四個階段：原核生物轉(zhuǎn)錄起始可分為四個階段： 中心酶在中心酶在因子參與下接觸到因子參與下接觸到DNA上；上；RNA聚合酶識別啟動子并與之結(jié)合，構(gòu)成封鎖性的起始復(fù)合物；聚合酶識別啟動子并與之結(jié)合，構(gòu)成封鎖性的起始復(fù)合物；酶結(jié)合在酶結(jié)

3、合在-10區(qū)，啟動子活化；然后解開雙鏈，暴露模板鏈；區(qū)，啟動子活化；然后解開雙鏈，暴露模板鏈；酶挪動到轉(zhuǎn)錄起始位點，加上第一個核苷三磷酸，構(gòu)成三元復(fù)合物，酶挪動到轉(zhuǎn)錄起始位點，加上第一個核苷三磷酸，構(gòu)成三元復(fù)合物，轉(zhuǎn)錄開場。轉(zhuǎn)錄開場。 四真核基因轉(zhuǎn)錄的起始四真核基因轉(zhuǎn)錄的起始真核生物轉(zhuǎn)錄起始非常復(fù)雜，往往需求多種蛋白因子的協(xié)助，曾經(jīng)知道，在一真核生物轉(zhuǎn)錄起始非常復(fù)雜，往往需求多種蛋白因子的協(xié)助，曾經(jīng)知道，在一切的細胞中有一類叫做轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)分子，它們與切的細胞中有一類叫做轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)分子，它們與RNA聚合酶聚合酶構(gòu)成轉(zhuǎn)構(gòu)成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，共同參與轉(zhuǎn)錄起始的過程。錄起始復(fù)合物，共同參與轉(zhuǎn)

4、錄起始的過程。 真核生物基因中，有專門為蛋白質(zhì)編碼的基因，這些基來由真核生物基因中，有專門為蛋白質(zhì)編碼的基因，這些基來由RNA聚合酶聚合酶擔(dān)擔(dān)任進展轉(zhuǎn)錄起始關(guān)鍵性作用。根據(jù)這些轉(zhuǎn)錄因子的作用特點可大致分為二類；任進展轉(zhuǎn)錄起始關(guān)鍵性作用。根據(jù)這些轉(zhuǎn)錄因子的作用特點可大致分為二類；第一類為普遍轉(zhuǎn)錄因子，它們與第一類為普遍轉(zhuǎn)錄因子，它們與RNA聚合酶聚合酶共同組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，轉(zhuǎn)共同組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，轉(zhuǎn)錄才干在正確的位置上開場。普遍轉(zhuǎn)錄因子是由多種蛋白質(zhì)分子組成的，其錄才干在正確的位置上開場。普遍轉(zhuǎn)錄因子是由多種蛋白質(zhì)分子組成的，其中包括特異結(jié)合在中包括特異結(jié)合在TATA盒上的蛋白質(zhì)，叫做盒上的

5、蛋白質(zhì)，叫做TATA盒結(jié)合蛋白，還有至成一盒結(jié)合蛋白，還有至成一組復(fù)合物叫做轉(zhuǎn)錄因子組復(fù)合物叫做轉(zhuǎn)錄因子D。TFD再與再與RNA聚合酶聚合酶結(jié)合完成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)結(jié)合完成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的構(gòu)成。合物的構(gòu)成。除除TFD以外，在細胞核提取物中還發(fā)現(xiàn)以外，在細胞核提取物中還發(fā)現(xiàn)TFA，TFF，TFE，TFH等，等，它們在轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物組裝的不同階段起作用，像它們在轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物組裝的不同階段起作用，像TFH就有旋轉(zhuǎn)酶活性，就有旋轉(zhuǎn)酶活性，它可利用它可利用ATP分解產(chǎn)生的能量，介導(dǎo)起始點雙螺旋的翻開，使分解產(chǎn)生的能量，介導(dǎo)起始點雙螺旋的翻開，使RNA聚合酶得聚合酶得以發(fā)揚作用。從中也不難看出真核細胞中基因轉(zhuǎn)

6、錄的起始是基因的表達調(diào)控以發(fā)揚作用。從中也不難看出真核細胞中基因轉(zhuǎn)錄的起始是基因的表達調(diào)控的關(guān)鍵，這么多蛋白質(zhì)分子之間相互作用，以及這些蛋白質(zhì)分子的關(guān)鍵，這么多蛋白質(zhì)分子之間相互作用，以及這些蛋白質(zhì)分子DNA調(diào)控元調(diào)控元件相結(jié)合，構(gòu)成控制基因轉(zhuǎn)錄開場的復(fù)雜體系。件相結(jié)合，構(gòu)成控制基因轉(zhuǎn)錄開場的復(fù)雜體系。 第二類轉(zhuǎn)錄因子為組織細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子或者叫可誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子，這此第二類轉(zhuǎn)錄因子為組織細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子或者叫可誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子，這此TF是在特異的組織細胞或是遭到一些類固醇激素，生長因子或其它刺激后，是在特異的組織細胞或是遭到一些類固醇激素，生長因子或其它刺激后，開場表達某些特異蛋白質(zhì)分子時，

7、才需求的一類轉(zhuǎn)錄因子。開場表達某些特異蛋白質(zhì)分子時，才需求的一類轉(zhuǎn)錄因子。 一原核生物一原核生物mRNA的特征的特征1 原核生物的mRNA半衰期短2 許多原核生物mRNA以多順反子的方式存在3 原核生物mRNA5端無帽子構(gòu)造，3端沒有或只需較短的poly(A)構(gòu)造。原核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯不僅發(fā)生在同一個細胞空間里，而且這兩個過程幾乎是同步進展的，蛋白質(zhì)合成往往在mRNA剛開場轉(zhuǎn)錄是被引發(fā)了。一個原核細胞的mRNA(包括病毒)有時可以編碼幾個多肽，而一個真核細胞的mRNA最多只能編碼一個多肽。1 半衰期較長，幾乎都是單順反子的方式存在2 真核生物的mRNA的5端存在帽子構(gòu)造。帽子構(gòu)造能

8、夠使mRNA免遭核酸酶的破壞。mRNA的帽子構(gòu)造經(jīng)常被甲基化3 絕大多數(shù)真核生物mRNA具有poly(A)尾巴真核細胞mRNA的最大特點在于它往往以一個較大分子質(zhì)量的前提RNA出如今核內(nèi)，只需成熟的，相對分子質(zhì)量明顯變小并經(jīng)化學(xué)修飾的mRNA才干進入細胞質(zhì)，參與蛋白質(zhì)的合成。所以，真核細胞的mRNA的合成和功能表達發(fā)生在不同的空間和時間范籌內(nèi)。二二 真核生物真核生物mRNA的特征的特征3.4 原核生物與真核生物原核生物與真核生物mRNA的特征比較的特征比較一一 RNA中的內(nèi)含子中的內(nèi)含子 斷裂基因：斷裂基因的存在闡明真核細胞的基因構(gòu)造和mRNA合成過程比原核細胞要復(fù)雜的多，由于真核基因的表達往

9、往伴隨著RNA的剪接過程，從mRNA前體分子中切除被稱為內(nèi)含子的非編碼區(qū)，并使基因中被稱為外顯子的編碼區(qū)拼接構(gòu)成成熟mRNA。真核基因大多是斷裂的，也就是說一個基因可由多個內(nèi)含子和外顯子間隔陳列而成。 外顯子：編碼蛋白質(zhì)的序列。 內(nèi)含子：初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物hnRNA加工產(chǎn)生成熟mRNA時被切除的間隔序列。研討闡明，內(nèi)含子在真核基因中所占的比例非常高，甚至超越99%。3.5 內(nèi)含子的剪接編輯及化學(xué)修飾內(nèi)含子的剪接編輯及化學(xué)修飾 研討闡明，許多相對分子質(zhì)量較小的核內(nèi)RNA以及與 這些RNA相結(jié)合的核蛋白(被稱為snRNPs)參與RNA的 剪接。mRNA鏈上每個內(nèi)含子的5和3段分別與不 同的snRNPs相

10、結(jié)合，構(gòu)成RNA和RNP復(fù)合物。 在高等真核生物中，內(nèi)含子通常是有序或組成性地從 mRNA前體中被剪接，然而，在個體發(fā)育或細胞分化 時可以有選擇地越過某些外顯子或某個剪接點進展變 位剪接，產(chǎn)生出組織或發(fā)育階段特異性mRNA，稱為 內(nèi)含子的變位剪接。 普通情況下，由u1snoRNA以堿基互補的方式識別mRNA前體5剪接點，由結(jié)合在3剪接點上游富嘧啶區(qū)的u2AF識別3剪接點，并引導(dǎo)u2snRNP與分支點相結(jié)合，構(gòu)成剪接前體，并進一步與 u4、 u5、 u6snRNP三聚體相結(jié)合，構(gòu)成60s的剪接體，進展RNA前體分子的剪接。二二 RNA的剪接的剪接 原核生物的構(gòu)造基因是延續(xù)編碼序列，而真核生物基因

11、往往是斷裂基因，即編碼一個蛋白質(zhì)分子的核苷酸序列被多個插入片斷所隔開，一個真核生物構(gòu)造基因中內(nèi)含子的數(shù)量，往往與這個基因的大小有關(guān)，例如胰島素是一個很小的蛋白質(zhì)，它構(gòu)造基因只需兩個內(nèi)含子，而有些很大的蛋白質(zhì)，它的構(gòu)造基因中可以有幾十個內(nèi)含子。經(jīng)過復(fù)雜的過程后，切去內(nèi)元，將有編碼意義的核苷酸片段外顯子銜接起來圖 RNA的編輯是某些RNA，特別是mRNA的一種加工方式，它導(dǎo)致了DNA所編碼的遺傳信息的改動，由于經(jīng)過編輯的mRNA的序列發(fā)生了不同于模版DNA的變化 RNA的編輯能夠是充分發(fā)揚生理功能所必需的。載體蛋白mRNA中的C-U,谷氨酸受體蛋白mRNA中的A-I，都屬于脫氨基作用的結(jié)果，分別由

12、胞嘧啶和腺嘌呤脫氨酶所催化。通常情況下，該酶促反響的特異性不強，腺嘌呤脫氨酶可以作用于雙鏈RNA區(qū)的任何腺苷酸殘基。但是，RNA的編輯發(fā)生在帶有催化作用的脫氨酶亞基的復(fù)合體中，有附加的RNA結(jié)合區(qū)能協(xié)助識別所編輯的特異性靶位點。 除了RNA的編輯之外，有些RNA，特別是前體rRNA和tRNA，還能夠有特異性化學(xué)修飾如下：三三 RNA的編輯和化學(xué)修飾的編輯和化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的生物合成步驟蛋白質(zhì)的生物合成步驟蛋白質(zhì)的合成是一個比DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄更為復(fù)雜的過程。它包括：(1)翻譯的起始 核糖體與mRNA結(jié)合并與氨酰-tRNA生成起始復(fù)合物。(2)肽鏈的延伸 由于核糖體沿mRNA5端向3端挪動，開場了

13、從N端向C端的多肽合成，這是蛋白質(zhì)合成過程中速度最快的階段。(3)肽鏈的終止及釋放 核糖體從mRNA上解離，預(yù)備新一輪合成反響。核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所。mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板。轉(zhuǎn)移RNA(transfer RNA，tRNA)是模板與氨基酸之間的接合體。第四章第四章 生物信息的傳送下生物信息的傳送下 在合成的各個階段有許多蛋白質(zhì)、酶和其他生物大分子參與。參與蛋白質(zhì)合成的各種組分約占細胞干重的35%。在真核生物中有將近300種生物大分子與蛋白質(zhì)的生物合成有關(guān)。 蛋白質(zhì)合成是一個需能反響，要有各種高能化合物的參與。細胞用來進展合成代謝的總能量的90%耗費在蛋白質(zhì)合成過程中。 在真核生物細胞核內(nèi)

14、合成的mRNA，要運送到細胞質(zhì)，才干翻譯生成蛋白質(zhì)。 所謂翻譯是指將mRNA鏈上的核苷酸從一個特定的起始位點開場，按每3個核苷酸代表一個氨基酸的原那么，依次合成一條多肽鏈的過程。 蛋白質(zhì)合成速度很高。大腸桿菌只需求5s就能合成一條由100個氨基酸組成的多肽。蛋白質(zhì)合成的生物學(xué)機制蛋白質(zhì)合成的生物學(xué)機制蛋白質(zhì)是生物活性物質(zhì)中最重要的大分子組分，生物有機體的遺傳學(xué)特性要經(jīng)過蛋白質(zhì)來得到表達。蛋白質(zhì)的生物合成包括氨基酸活化、肽鏈的起始、伸長、終止以及新合成多肽鏈的折疊和加工。1氨基酸的活化：蛋白質(zhì)合成的起始需求核糖體大小亞基、起始tRNA和幾十個蛋白因子。在mRNA編碼區(qū)5端構(gòu)成核糖體-mRNA-起

15、始tRNA復(fù)合物并將甲硫氨酸放入核糖體P位點。2翻譯的起始：細菌中翻譯的起始需求如下7種成分:30S小亞基，模板mRNA，fMet-tRNAfMet，3個翻譯起始因子(IF-l、IF-2和IF-3)，GTP，50S大亞基，Mg2。翻譯起始又可被分成3步。第一步，30S小亞基與翻譯起始因子IF-l，IF-3的作用下經(jīng)過mRNA 的SD序列與之相結(jié)合。第二步，在IF-2和GTP的協(xié)助下，fMet-tRNAfMet進入小亞基的P位，tRNA上的反密碼子與mRNA上的起始密碼子配對。第三步，帶有tRNA、mRNA及3個翻譯起始因子的小亞基復(fù)合物與50S大亞基結(jié)合；然后，釋放翻譯起始因子。3肽鏈的延伸：

16、當(dāng)?shù)谝粋€氨基酸與核糖體結(jié)合以后，按照肽鏈的延伸：當(dāng)?shù)谝粋€氨基酸與核糖體結(jié)合以后，按照mRNA模板密模板密碼子的陳列，氨基酸經(jīng)過新生肽鍵的方式被有序地結(jié)合上去。碼子的陳列，氨基酸經(jīng)過新生肽鍵的方式被有序地結(jié)合上去。 每加一個每加一個AA是一個循環(huán)，每個循環(huán)包括是一個循環(huán)，每個循環(huán)包括AA-tRNA與核糖體結(jié)合、肽鍵與核糖體結(jié)合、肽鍵的生成和移位。的生成和移位。4肽鏈的終止：肽鏈在延伸過程中，當(dāng)終止密碼子出如今核糖體的肽鏈的終止：肽鏈在延伸過程中，當(dāng)終止密碼子出如今核糖體的A位位時，沒有相應(yīng)的時，沒有相應(yīng)的AA-tRNA能與之結(jié)合，而釋放因子能識別終止密碼子并能與之結(jié)合，而釋放因子能識別終止密碼子

17、并與之結(jié)合，水解與之結(jié)合，水解P位上多肽鏈與位上多肽鏈與tRNA之間的酯鍵。新生的肽鏈和之間的酯鍵。新生的肽鏈和tRNA從核糖體上釋放，核糖體解體，蛋白質(zhì)合成終了。釋放因子從核糖體上釋放，核糖體解體，蛋白質(zhì)合成終了。釋放因子RF催化催化GTP水解促使肽鏈與核糖體解離。水解促使肽鏈與核糖體解離。5蛋白質(zhì)前體的加工：新生多肽鏈大多數(shù)是沒有功能的，必需經(jīng)過加工蛋白質(zhì)前體的加工：新生多肽鏈大多數(shù)是沒有功能的，必需經(jīng)過加工修飾才干轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牡鞍踪|(zhì)。修飾才干轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牡鞍踪|(zhì)。 1N端端fMet或或Met的切除；的切除； 2二硫二硫鍵的構(gòu)成鍵的構(gòu)成 二硫鍵是蛋白質(zhì)合成后經(jīng)過兩個半胱氨酸的氧化作用生成

18、的。二硫鍵是蛋白質(zhì)合成后經(jīng)過兩個半胱氨酸的氧化作用生成的。3特定氨基酸的修飾特定氨基酸的修飾 氨基酸側(cè)鏈的修飾包括磷酸化氨基酸側(cè)鏈的修飾包括磷酸化(如核糖體蛋白質(zhì)如核糖體蛋白質(zhì))、糖基化糖基化(如各種糖蛋白如各種糖蛋白)、甲基化、甲基化(如組蛋白、肌肉蛋白質(zhì)如組蛋白、肌肉蛋白質(zhì))、乙基化、乙基化(如組如組蛋白蛋白)、羥基化、羥基化(如膠原蛋白如膠原蛋白)和竣基化等。和竣基化等。蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)機制蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)機制 蛋白質(zhì)的合成位點與功能位點經(jīng)常被細胞內(nèi)的膜所隔開，蛋白質(zhì)需求運轉(zhuǎn)。核糖體是真核生物細胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的場所，任何時候都有許多蛋白質(zhì)被保送到細胞質(zhì)、細胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等各個部分，補充和更新細

19、胞功能。細胞各部分都有特定的蛋白質(zhì)組分，蛋白質(zhì)必需準(zhǔn)確無誤地定向運送才干保證生命活動的正常進展。 蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)可分為兩大類: 1、翻譯運轉(zhuǎn)同步機制：蛋白質(zhì)的合成和運轉(zhuǎn)同時發(fā)生，那么屬于; 2、翻譯后運轉(zhuǎn)機制：蛋白質(zhì)從核糖體上釋放后才發(fā)生運轉(zhuǎn)。 分泌蛋白質(zhì)大多是以同步機制運輸?shù)摹?在細胞器發(fā)育過程中，由細胞質(zhì)進入細胞器的蛋白質(zhì)大多是以翻譯后運轉(zhuǎn)機制運輸?shù)摹?參與生物膜構(gòu)成的蛋白質(zhì)，依賴于上述兩種不同的運轉(zhuǎn)機制鑲?cè)肽?nèi)。1 翻譯翻譯-運轉(zhuǎn)同步機制運轉(zhuǎn)同步機制分泌蛋白的生物合成開場于核糖體，翻譯到大約50個氨基酸殘基，信號肽開場從核糖體的大亞基顯露，被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的受體識別并與之結(jié)合。信號肽過膜后被內(nèi)質(zhì)

20、網(wǎng)腔的信號肽酶水解，新生肽隨之經(jīng)過蛋白孔道穿越疏水的雙層磷脂。當(dāng)核糖體移到mRNA的“終止密碼子，蛋白質(zhì)合成即告完成，翻譯體系解散，膜上的蛋白孔道消逝，核糖體重新處于自在形狀。蛋白質(zhì)定位的信息存在于該蛋白質(zhì)本身構(gòu)造中，并且經(jīng)過與膜上特殊受體的相互作用得以表達。信號肽緊接在起始密碼之后，大部分是疏水氨基酸。信號肽的長度在1336個殘基。 信號肽的特點：1、1015個疏水氨基酸；2、N端有帶正電荷的氨基酸；3、C端接近切割點處代數(shù)個極性氨基酸；4、C端氨基酸側(cè)鏈短。2 翻譯后運轉(zhuǎn)機制 葉綠體和線粒體中有許多蛋白質(zhì)和酶是由細胞質(zhì)提供的，其中絕大多數(shù)以翻譯后運轉(zhuǎn)機制進入細胞器內(nèi)。2.1 線粒體蛋白質(zhì)跨

21、膜運轉(zhuǎn)線粒體蛋白質(zhì)跨膜運轉(zhuǎn)特征:1、經(jīng)過線粒體膜的蛋白質(zhì)在運轉(zhuǎn)之前大多數(shù)以前體方式存在，它由成熟蛋白質(zhì)和位于N端的一段前導(dǎo)肽(leader peptide)共同組成,前導(dǎo)肽約含2080個氨基酸殘基，當(dāng)前體蛋白過膜時，前導(dǎo)肽被多肽酶所水解，釋放成熟蛋白質(zhì)。 2、蛋白質(zhì)經(jīng)過線粒體膜運轉(zhuǎn)時，首先由外膜上的Tom受體復(fù)合蛋白識別與分子伴侶相結(jié)合的待運轉(zhuǎn)多肽，經(jīng)過Tom和Tim組成的膜通道進入線粒體內(nèi)腔。蛋白質(zhì)跨膜運轉(zhuǎn)時的能量來自線粒體Hsp70引發(fā)的ATP水解和膜電位差。2.2 前導(dǎo)肽的作用與性質(zhì)擁有前導(dǎo)肽的線粒體蛋白質(zhì)前體可以跨膜運轉(zhuǎn)進人線粒體，在這一過程中前導(dǎo)肽被水解，前體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓鞍?，那么失?/p>

22、繼續(xù)跨膜才干。因此，前導(dǎo)肽對線粒體蛋白質(zhì)的識別和跨膜運轉(zhuǎn)起著關(guān)鍵作用。前導(dǎo)肽具有如下特性:帶正電荷的堿性氨基酸(特別是精氨酸)含量較為豐富，它們分散于不帶電荷的氨基酸序列之間;短少帶負電荷的酸性氨基酸；羥基氨基酸(特別是絲氨酸)含量較高;有構(gòu)成兩親(既有親水又有疏水部分)-螺旋構(gòu)造的才干3 核定位蛋白的運轉(zhuǎn)機制核定位蛋白的運轉(zhuǎn)機制蛋白質(zhì)普統(tǒng)統(tǒng)過核孔進入細胞核。核糖體蛋白首先在細胞質(zhì)中合成，運轉(zhuǎn)到細胞核內(nèi)，在核仁中被裝配成40S和60S核糖體亞基，然后運轉(zhuǎn)回到細胞質(zhì)中去合成蛋白質(zhì)合成。RNA、DNA聚合酶、組蛋白、拓撲異構(gòu)酶及大量轉(zhuǎn)錄、復(fù)制調(diào)控因子都必需從細胞質(zhì)進入細胞核才干正常發(fā)揚功能。在多細

23、胞真核生物中，每當(dāng)細胞發(fā)生分裂時，核膜被破壞，等到細胞分裂完成后，核膜被重新建成，分散在細胞內(nèi)的核蛋白必需被重新運入核內(nèi)，因此，為了核蛋白的反復(fù)定位，這些蛋白質(zhì)中的信號肽被稱為核定位序列(nuclear localization sequence, NLS)普通都不被切除。NLS可以位于核蛋白的任何部位。蛋白質(zhì)向核內(nèi)運輸?shù)倪^程蛋白質(zhì)向核內(nèi)運輸過程需求核運轉(zhuǎn)因子、和一個GTP酶(Ran)。和組成的異源二聚體是核定位蛋白的可溶性受體，與核定位序列相結(jié)合的是亞基。由上述3個蛋白組成的復(fù)合物?？吭诤丝滋帲劳蠷an GTP酶水解GTP提供的能量進入細胞核，和亞基解離，核蛋白與亞基解離，和分別經(jīng)過核孔復(fù)

24、合體回到細胞質(zhì)中，起始新一輪蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)。4 蛋白質(zhì)的降解蛋白質(zhì)的降解甲基化：在核苷酸或核糖基上加一個或多個-CH3 。舉例：鳥嘌呤甲基化產(chǎn)物MTG去氨基化：從堿基上去掉氨基。舉例：鳥嘌呤去氨基后成為次黃嘌呤。硫代：用硫代取代堿基分子上的氧。舉例：4-硫脲嘧啶。堿基的同分異構(gòu)化：堿基環(huán)構(gòu)造上發(fā)生分子替代。舉例：脲嘧啶同分異構(gòu)化生成假脲嘧啶。二價鍵的飽和化把一個二價鍵飽和。舉例：二氫脲嘧啶。核苷酸的替代：用不常見核苷酸交換常見核苷酸，舉例：荃嘧啶DNA甲基化能夠存在于一切高等生物中并與基因表達調(diào)控親密相關(guān)，DNA甲基化能封鎖某些基因的活性，去甲基化那么誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達。DNA甲基化能引起

25、染色體構(gòu)造、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改動，從而控制基因表達。第六章第六章 原核基因表達調(diào)控原核基因表達調(diào)控基因表達調(diào)控主要表如今以下幾個方面：基因表達調(diào)控主要表如今以下幾個方面： 轉(zhuǎn)錄程度上的調(diào)控轉(zhuǎn)錄程度上的調(diào)控(transcriptional regulation)； mRNA加工成熟程度上的調(diào)控加工成熟程度上的調(diào)控(differential processing of RNA transcript)； 翻譯程度上的調(diào)控翻譯程度上的調(diào)控(differential translation of mRNA).原核生物中，營養(yǎng)情況原核生物中，營養(yǎng)情況(nutritio

26、nalstatus)和環(huán)境要素和環(huán)境要素(environmental factor)對基因表達起著舉足輕重的影響。對基因表達起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素程度在真核生物尤其是高等真核生物中，激素程度(hormone level)和發(fā)育階段和發(fā)育階段(developmental stage)是基因表達調(diào)控是基因表達調(diào)控的最主要手段，營養(yǎng)和環(huán)境要素的影響力大為下降。的最主要手段，營養(yǎng)和環(huán)境要素的影響力大為下降。 1、真核與原核基因組構(gòu)造差別真核：真核：真核基因組構(gòu)造龐大真核基因組構(gòu)造龐大: 如人類細胞單倍體基因組就包含如人類細胞單倍體基因組就包含3109bpDNA，約為大

27、腸桿菌總約為大腸桿菌總DNA的的800倍倍單順反子單順反子基因不延續(xù)性基因不延續(xù)性:斷裂基因斷裂基因interrupted gene、內(nèi)含子、內(nèi)含子(intron)、 外外顯子顯子(exon)非編碼區(qū)較多非編碼區(qū)較多 多于編碼序列多于編碼序列(9:1)含有大量反復(fù)序列含有大量反復(fù)序列原核：原核： 基因組很小，大多只需一條染色體基因組很小，大多只需一條染色體 構(gòu)造簡煉構(gòu)造簡煉 存在轉(zhuǎn)錄單元多順反子存在轉(zhuǎn)錄單元多順反子 有重疊基因有重疊基因第七章第七章 基因的表達與調(diào)控基因的表達與調(diào)控(下下) 真核生物基因調(diào)控可分為兩大真核生物基因調(diào)控可分為兩大類：第一類是瞬時調(diào)控或稱可類：第一類是瞬時調(diào)控或稱可

28、逆性調(diào)控，它相當(dāng)于原核生物逆性調(diào)控，它相當(dāng)于原核生物細胞對環(huán)境條件所做出的反響，細胞對環(huán)境條件所做出的反響，包括某種底物或激素程度升降包括某種底物或激素程度升降時，或細胞周期不同階段中酶時，或細胞周期不同階段中酶活性的調(diào)理；第二類是發(fā)育調(diào)活性的調(diào)理；第二類是發(fā)育調(diào)控或稱不可逆調(diào)控，使真核基控或稱不可逆調(diào)控，使真核基因調(diào)控的精華部分，它決議真因調(diào)控的精華部分，它決議真核細胞生長分化發(fā)育的全部進核細胞生長分化發(fā)育的全部進程。程。二、真核細胞與原核細胞在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及二、真核細胞與原核細胞在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及DNA的空間構(gòu)造方面存在以的空間構(gòu)造方面存在以下幾個方面的差別下幾個方面的差別 在真核細胞中

29、，一條成熟的在真核細胞中，一條成熟的mRNA鏈只能翻譯出一條多肽鏈，很少存在鏈只能翻譯出一條多肽鏈，很少存在原核生物中常見的多基因支配子方式。原核生物中常見的多基因支配子方式。 真核細胞真核細胞DNA與組蛋白和大量非組蛋白相結(jié)合，只需一小部分與組蛋白和大量非組蛋白相結(jié)合，只需一小部分DNA是裸是裸露的。露的。 高等真核細胞高等真核細胞DNA中很大部分是不轉(zhuǎn)錄的，大部分真核細胞的基因中間中很大部分是不轉(zhuǎn)錄的，大部分真核細胞的基因中間還存在不被翻譯的內(nèi)含子。還存在不被翻譯的內(nèi)含子。 真核生物可以有序地根據(jù)生長發(fā)育階段的需求進展真核生物可以有序地根據(jù)生長發(fā)育階段的需求進展DNA片段重排，還能片段重排

30、，還能在需求時添加細胞內(nèi)某些基因的拷貝數(shù)。在需求時添加細胞內(nèi)某些基因的拷貝數(shù)。 在真核生物中，基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)理區(qū)相對較大，它們能夠遠離啟動子達幾在真核生物中，基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)理區(qū)相對較大，它們能夠遠離啟動子達幾百個甚至上千個堿基對，這些調(diào)理區(qū)普統(tǒng)統(tǒng)過改動整個所控制基因百個甚至上千個堿基對，這些調(diào)理區(qū)普統(tǒng)統(tǒng)過改動整個所控制基因5上游區(qū)上游區(qū)DNA構(gòu)型來影響構(gòu)型來影響RNA聚合酶與它的結(jié)合。聚合酶與它的結(jié)合。 在原核生物中，轉(zhuǎn)錄的調(diào)理區(qū)都很小，大都位于啟動子上游不遠處，在原核生物中，轉(zhuǎn)錄的調(diào)理區(qū)都很小，大都位于啟動子上游不遠處，調(diào)控蛋白結(jié)合到調(diào)理位點上可直接促進或抑制調(diào)控蛋白結(jié)合到調(diào)理位點上可直接促進或

31、抑制RNA聚合酶與它的結(jié)合。聚合酶與它的結(jié)合。 真核生物的真核生物的RNA在細胞核中合成，只需經(jīng)轉(zhuǎn)運穿過核膜，到達細胞質(zhì)后，在細胞核中合成，只需經(jīng)轉(zhuǎn)運穿過核膜，到達細胞質(zhì)后，才干被翻譯成蛋白質(zhì)，原核生物中不存在這樣嚴厲的空間間隔。才干被翻譯成蛋白質(zhì)，原核生物中不存在這樣嚴厲的空間間隔。 許多真核生物的基因只需經(jīng)過復(fù)雜的成熟和剪接過程，才干順利地翻譯許多真核生物的基因只需經(jīng)過復(fù)雜的成熟和剪接過程，才干順利地翻譯成蛋白質(zhì)。成蛋白質(zhì)。加強子、特點、作用原理加強子、特點、作用原理加強子是指能使與它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯添加的加強子是指能使與它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯添加的DNADNA序列。序列。加強子特

32、點：加強子特點： 加強效應(yīng)十清楚顯，普通能使基因轉(zhuǎn)錄頻率添加加強效應(yīng)十清楚顯，普通能使基因轉(zhuǎn)錄頻率添加10-20010-200倍倍 加強效應(yīng)與其位置和取向無關(guān)，不論加強子以什么方向陳列加強效應(yīng)與其位置和取向無關(guān)，不論加強子以什么方向陳列5 533或或3 355，甚至和靶基因相距，甚至和靶基因相距3kb3kb，或在靶基因下游，或在靶基因下游，均表現(xiàn)出加強效應(yīng)；均表現(xiàn)出加強效應(yīng)；大多為反復(fù)序列，普通長約大多為反復(fù)序列，普通長約50bp50bp，適宜與某些蛋白因子結(jié)合。，適宜與某些蛋白因子結(jié)合。其內(nèi)部常含有一個中心序列：其內(nèi)部常含有一個中心序列：G GTGGA/TA/TA/TTGGA/TA/TA/T

33、G G，該序，該序列是產(chǎn)生加強效應(yīng)時所必需的；列是產(chǎn)生加強效應(yīng)時所必需的； 加強效應(yīng)有嚴密的組織和細胞特異性，闡明加強子只需與加強效應(yīng)有嚴密的組織和細胞特異性，闡明加強子只需與特定的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子相互作用才干發(fā)揚其功能；特定的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子相互作用才干發(fā)揚其功能； 沒有基因?qū)Ｗ⑿?，可以在不同的基因組合上表現(xiàn)加強效應(yīng)；沒有基因?qū)Ｗ⑿裕梢栽诓煌幕蚪M合上表現(xiàn)加強效應(yīng)； 許多加強子還受外部信號的調(diào)控，許多加強子還受外部信號的調(diào)控，如金屬硫蛋白的基因啟動區(qū)上游所帶的加強子，就可以對環(huán)境如金屬硫蛋白的基因啟動區(qū)上游所帶的加強子，就可以對環(huán)境中的鋅、鎘濃度做出反響。中的鋅、鎘濃度做出反響。作用原理：加

34、強子能夠有以下三種作用機制：作用原理：加強子能夠有以下三種作用機制：影響模版附近的影響模版附近的DNA雙螺旋構(gòu)造，導(dǎo)致雙螺旋構(gòu)造，導(dǎo)致DNA雙螺旋彎折或在反式因子的參雙螺旋彎折或在反式因子的參與下，以蛋白質(zhì)之間的相互作用為媒介構(gòu)成加強子與啟動子之間與下，以蛋白質(zhì)之間的相互作用為媒介構(gòu)成加強子與啟動子之間“成成環(huán)銜接，活化基因轉(zhuǎn)錄；環(huán)銜接，活化基因轉(zhuǎn)錄；將模版固定在細胞核內(nèi)特定位置，如銜接在核基質(zhì)上，有利于將模版固定在細胞核內(nèi)特定位置，如銜接在核基質(zhì)上，有利于DNA拓撲異拓撲異構(gòu)酶改動構(gòu)酶改動DNA雙螺旋構(gòu)造的張力，促進雙螺旋構(gòu)造的張力，促進RNA聚合酶聚合酶在在DNA鏈上的鏈上的結(jié)合和滑動；結(jié)

35、合和滑動；加強子區(qū)可作為反式作用因子或加強子區(qū)可作為反式作用因子或RNA聚合酶聚合酶進入染色質(zhì)構(gòu)造的進入染色質(zhì)構(gòu)造的“入口入口7.4 真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主要方式真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主要方式細胞除經(jīng)過細胞除經(jīng)過DNA復(fù)制和隨后的細胞分裂將本身所固有的遺傳信息由親代傳復(fù)制和隨后的細胞分裂將本身所固有的遺傳信息由親代傳至子代，它們還不斷地至子代，它們還不斷地“感知環(huán)境的各種變化，并對其作出特有的感知環(huán)境的各種變化，并對其作出特有的應(yīng)對。細胞應(yīng)對可分為三個階段：應(yīng)對。細胞應(yīng)對可分為三個階段：外界信息的感知，既由細胞膜到細胞核內(nèi)的信息傳送；外界信息的感知，既由細胞膜到細胞核內(nèi)的信息傳送；染色質(zhì)程度上的基因

36、活性調(diào)控；染色質(zhì)程度上的基因活性調(diào)控；特定基因的表達。特定基因的表達。4.1 蛋白質(zhì)磷酸化、信號傳導(dǎo)及基因的表達蛋白質(zhì)磷酸化、信號傳導(dǎo)及基因的表達蛋白質(zhì)磷酸化與去磷酸化過程是生物體內(nèi)普遍存在的信息傳導(dǎo)方式，幾蛋白質(zhì)磷酸化與去磷酸化過程是生物體內(nèi)普遍存在的信息傳導(dǎo)方式，幾乎涉及一切的生理及病理過程。乎涉及一切的生理及病理過程。細胞外表受體與配體分子的高親和力特異性結(jié)合，能誘導(dǎo)蛋白想象變化，細胞外表受體與配體分子的高親和力特異性結(jié)合，能誘導(dǎo)蛋白想象變化，使細胞外信號順利經(jīng)過質(zhì)膜進入細胞內(nèi)，或是受體發(fā)生寡聚化而被使細胞外信號順利經(jīng)過質(zhì)膜進入細胞內(nèi)，或是受體發(fā)生寡聚化而被激活。普通情況下，受體分子活化

37、細胞功能的途徑有兩條：一是受激活。普通情況下，受體分子活化細胞功能的途徑有兩條：一是受體本身或受體結(jié)合蛋白具有內(nèi)源酪氨酸激酶活性，胞內(nèi)信號經(jīng)過酪體本身或受體結(jié)合蛋白具有內(nèi)源酪氨酸激酶活性，胞內(nèi)信號經(jīng)過酪氨酸激酶途徑得到傳送；二是配體與細胞外表受體結(jié)合，經(jīng)過氨酸激酶途徑得到傳送；二是配體與細胞外表受體結(jié)合，經(jīng)過G蛋蛋白介導(dǎo)的效應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生介質(zhì)，活化絲氨酸白介導(dǎo)的效應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生介質(zhì)，活化絲氨酸/蘇氨酸或酪氨酸激酶，蘇氨酸或酪氨酸激酶，從而傳送信號。從而傳送信號。4.2 激素及其影響激素及其影響 許多類固醇激素如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮激素和雄激素許多類固醇激素如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮激素和雄

38、激素以及普通代謝性激素的調(diào)控都是經(jīng)過啟動基因轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)的。靶細以及普通代謝性激素的調(diào)控都是經(jīng)過啟動基因轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)的。靶細胞具有專注的細胞受體，可與激素構(gòu)成復(fù)合物，導(dǎo)致三維構(gòu)造甚至胞具有專注的細胞受體，可與激素構(gòu)成復(fù)合物，導(dǎo)致三維構(gòu)造甚至化學(xué)性質(zhì)的變化。經(jīng)修飾的受體與激素復(fù)合物經(jīng)過核膜進入細胞核化學(xué)性質(zhì)的變化。經(jīng)修飾的受體與激素復(fù)合物經(jīng)過核膜進入細胞核內(nèi)，并與染色質(zhì)的特定區(qū)域相結(jié)合，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的起始或封鎖內(nèi)，并與染色質(zhì)的特定區(qū)域相結(jié)合，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的起始或封鎖許多類固醇激素如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮激素和雄激素以許多類固醇激素如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮激素和雄激素以及普通代謝性激素的調(diào)

39、控都是經(jīng)過啟動基因轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)的。三種假及普通代謝性激素的調(diào)控都是經(jīng)過啟動基因轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)的。三種假說：受體流動假說、中介物假說、鄰位互調(diào)假說。說：受體流動假說、中介物假說、鄰位互調(diào)假說。熱激蛋白誘導(dǎo)的基因表達熱激蛋白誘導(dǎo)的基因表達1 基因工程與基因治療的差別基因工程與基因治療的差別基因工程是將具有運用價值的基因，即基因工程是將具有運用價值的基因，即“目的基因，裝配在具有表達元件的特目的基因，裝配在具有表達元件的特定載體中，導(dǎo)入相應(yīng)的宿主如細菌、酵母或哺乳動物細胞中，在體外進展定載體中，導(dǎo)入相應(yīng)的宿主如細菌、酵母或哺乳動物細胞中，在體外進展擴增，經(jīng)分別、純化后獲得其表達的蛋白產(chǎn)物?；蛑委熓菍⒕哂?/p>

40、治療價擴增，經(jīng)分別、純化后獲得其表達的蛋白產(chǎn)物?；蛑委熓菍⒕哂兄委焹r值的基因，即值的基因，即“治療基因裝配于帶有在人體細胞中表達所必備元件的載治療基因裝配于帶有在人體細胞中表達所必備元件的載體中，導(dǎo)入人體細胞，直接進展表達。體中，導(dǎo)入人體細胞，直接進展表達?？纱蟠蠼档椭委煴惧X。由于基因治療不需求基因工程中耗資最大的器材與資料可大大降低治療本錢。由于基因治療不需求基因工程中耗資最大的器材與資料費用，顯著降低了工業(yè)化的本錢。費用，顯著降低了工業(yè)化的本錢。基因工程的基因工程的“目的基因主要是可分泌蛋白，如生長因子、多肽類激素、細胞因目的基因主要是可分泌蛋白，如生長因子、多肽類激素、細胞因子、可溶性

41、受體等，對于非分泌性蛋白質(zhì)，由于它們往往不能有效地進入子、可溶性受體等，對于非分泌性蛋白質(zhì)，由于它們往往不能有效地進入細胞而不能被運用于基因工程。但基因治療不受上述限制。幾乎一切的基細胞而不能被運用于基因工程。但基因治療不受上述限制。幾乎一切的基因，只需它具有治療作用，實際上均可運用于基因治療。因此，基因治療因，只需它具有治療作用，實際上均可運用于基因治療。因此，基因治療具有更大的潛力。具有更大的潛力?；蚬こ痰牟僮魅吭隗w外完成，基因治療那么必需將基因直接導(dǎo)入人體細胞。基因工程的操作全部在體外完成，基因治療那么必需將基因直接導(dǎo)入人體細胞。這不僅在技術(shù)上具有很大的難度，而且在平安性與有效性方面

42、提出了更為這不僅在技術(shù)上具有很大的難度，而且在平安性與有效性方面提出了更為苛刻的要求?？量痰囊蟆；蚬こ淘?jīng)有三四十年的歷史，技術(shù)已比較成熟；基因治療僅有十多年的歷基因工程曾經(jīng)有三四十年的歷史，技術(shù)已比較成熟；基因治療僅有十多年的歷史，不少技術(shù)還不夠成熟。所以，它遇到的風(fēng)險更大。史，不少技術(shù)還不夠成熟。所以，它遇到的風(fēng)險更大。2 2 基因治療的概念和戰(zhàn)略基因治療的概念和戰(zhàn)略基因治療基因治療(gene therapy)(gene therapy)就是用正?；蛞吧途褪怯谜；蛞吧?wild type)(wild type)基因矯正或置換致病基因矯正或置換致病基因的一種治療方法。在這種治療方法

43、中，目的基因被導(dǎo)入到靶細胞基因的一種治療方法。在這種治療方法中，目的基因被導(dǎo)入到靶細胞target cellstarget cells內(nèi)，它們或與宿主細胞內(nèi)，它們或與宿主細胞host cellhost cell染色體整合成為宿主染色體整合成為宿主遺傳物質(zhì)的一部分，或不與染色體整合而位于染色體外，但都能在細胞中得遺傳物質(zhì)的一部分，或不與染色體整合而位于染色體外，但都能在細胞中得到表達，起到治療疾病的作用。到表達，起到治療疾病的作用。 目前基因治療的概念了較大的擴展，凡是采用分子生物學(xué)的方法和原理，在核酸目前基因治療的概念了較大的擴展，凡是采用分子生物學(xué)的方法和原理，在核酸程度上開展的疾病治療方法

44、都可稱為基因治療。隨著對疾病本質(zhì)的深化了解程度上開展的疾病治療方法都可稱為基因治療。隨著對疾病本質(zhì)的深化了解和新的分子生物學(xué)方法的不斷涌現(xiàn)，基因治療方法有了較大的開展。根據(jù)所和新的分子生物學(xué)方法的不斷涌現(xiàn)，基因治療方法有了較大的開展。根據(jù)所采用的方法不同，基因治療的戰(zhàn)略大致可分為以下幾種：采用的方法不同，基因治療的戰(zhàn)略大致可分為以下幾種：基因置換基因置換gene replacementgene replacement：基因置換就是用正常的基因原位交換病變細胞：基因置換就是用正常的基因原位交換病變細胞內(nèi)的致病基因，使細胞內(nèi)的內(nèi)的致病基因，使細胞內(nèi)的DNADNA完全恢復(fù)正常形狀。這種治療方法最為理

45、想，完全恢復(fù)正常形狀。這種治療方法最為理想，但目前由于技術(shù)緣由尚難到達。但目前由于技術(shù)緣由尚難到達。 基因修復(fù)基因修復(fù)gene correctiongene correction：基因修復(fù)是指將致病基因的突變堿基序列糾正，：基因修復(fù)是指將致病基因的突變堿基序列糾正，而正常部分予以保管。這種基因治療方式最后也能使致病基因得到完全恢復(fù)，而正常部分予以保管。這種基因治療方式最后也能使致病基因得到完全恢復(fù)，操作上要求高，實際中有一定難度。操作上要求高，實際中有一定難度。 基因修飾基因修飾gene augmentationgene augmentation又稱基因增補，將目的基因?qū)氩∽兗毎蚱溆址Q基因

46、增補，將目的基因?qū)氩∽兗毎蚱渌毎?，目的基因的表達產(chǎn)物能修飾缺陷細胞的功能或使原有的某些功能得它細胞，目的基因的表達產(chǎn)物能修飾缺陷細胞的功能或使原有的某些功能得以加強。在這種治療方法中，缺陷基因依然存在于細胞內(nèi)，目前基因治療多以加強。在這種治療方法中，缺陷基因依然存在于細胞內(nèi)，目前基因治療多采用這種方式。如將組織型纖溶酶原激活劑的基因?qū)胙軆?nèi)皮細胞并得以采用這種方式。如將組織型纖溶酶原激活劑的基因?qū)胙軆?nèi)皮細胞并得以表達后，防止經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)誘發(fā)的血檢構(gòu)成。表達后，防止經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)誘發(fā)的血檢構(gòu)成。u 基因失活gene inactivation：利用反義技術(shù)能特異地封鎖基因表達

47、特性，抑制一些有害基因的表達，已到達治療疾病的目的。如利用反義RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表達，抑制腫瘤細胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞的分化。用此技術(shù)還可封鎖腫瘤細胞的耐藥基因的表達，添加化療效果。 u 免疫調(diào)理immune adjustment：將抗體、抗原或細胞因子的基因?qū)爰踩梭w內(nèi)，改動病人免疫形狀，到達預(yù)防和治療疾病的目的。如將白細胞介素-2導(dǎo)入腫瘤病人體內(nèi)，提高病人IL-2的程度，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性，到達防治腫瘤復(fù)發(fā)的目的。 u 其它：添加腫瘤細胞對放療或化療的敏感性：采用給予前體藥物的方法減少化療藥物對正常細胞的損用力。如向腫瘤細胞中導(dǎo)入單純皰疹病毒胸苷激酶基因，然后

48、給予病人無毒性GCV藥物，由于只需含HSV-TK基因的細胞才干將CGV轉(zhuǎn)化成有毒的藥物。因此腫瘤細胞被殺死，而對正常細胞無影響。3 3 基因治療的根本程序基因治療的根本程序1 1目的基因的選擇和制備：目的基因的選擇和制備： 可用于基因治療的基因需滿足以下幾點：在體內(nèi)僅有少量的表達就可顯著改善病可用于基因治療的基因需滿足以下幾點：在體內(nèi)僅有少量的表達就可顯著改善病癥；該基因的過高表達不會對機體呵斥危害。癥；該基因的過高表達不會對機體呵斥危害。 在確定欲選目的基因后，就要制備目的基因。正向表達的基因可以是在確定欲選目的基因后，就要制備目的基因。正向表達的基因可以是cDNAcDNA，也可，也可是基因

49、組是基因組DNADNA片段。可用傳統(tǒng)的方法獲取，也可采用多聚酶鏈?zhǔn)椒错懫?。可用傳統(tǒng)的方法獲取，也可采用多聚酶鏈?zhǔn)椒错?PCR)(PCR)等等新技術(shù)進展體外擴增。部分反義基因也可采用此法獲得，但多數(shù)情況下采用新技術(shù)進展體外擴增。部分反義基因也可采用此法獲得，但多數(shù)情況下采用人工合成的方式制備人工合成的方式制備 2 2基因的轉(zhuǎn)運基因的轉(zhuǎn)運 目前已有多種基因轉(zhuǎn)運的方式，其根本原那么是將外源基因運到細胞內(nèi)。已運用目前已有多種基因轉(zhuǎn)運的方式，其根本原那么是將外源基因運到細胞內(nèi)。已運用的有病毒載體和非病毒載體兩大類。的有病毒載體和非病毒載體兩大類。 病毒載體：病毒具有一些獨特的性質(zhì)如多數(shù)病毒可感染特異的

50、細胞，在細胞內(nèi)不病毒載體：病毒具有一些獨特的性質(zhì)如多數(shù)病毒可感染特異的細胞，在細胞內(nèi)不易降解；易降解；RNARNA病毒能整合到染色體以及基因程度較高等。因此病毒載體是良好病毒能整合到染色體以及基因程度較高等。因此病毒載體是良好的基因轉(zhuǎn)運載體。目前已被用作載體的病毒有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)的基因轉(zhuǎn)運載體。目前已被用作載體的病毒有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)的病毒、皰疹病毒和肝炎病毒等。逆轉(zhuǎn)錄病毒用作載體時需進展幾步改造：的病毒、皰疹病毒和肝炎病毒等。逆轉(zhuǎn)錄病毒用作載體時需進展幾步改造： A A：將天然的野生型：將天然的野生型RNARNA前病毒轉(zhuǎn)變成前病毒轉(zhuǎn)變成DNADNA載體，并插入欲轉(zhuǎn)移的相

51、關(guān)外源基因。載體，并插入欲轉(zhuǎn)移的相關(guān)外源基因。其根本原那么是用標(biāo)志基因和外源基因替代病毒的編碼基因。其根本原那么是用標(biāo)志基因和外源基因替代病毒的編碼基因。B B：制備輔助細：制備輔助細胞為載體胞為載體DNADNA提供其喪失的功能提供其喪失的功能 C C：將載體：將載體DNADNA導(dǎo)入輔助以產(chǎn)生病毒載體。導(dǎo)入輔助以產(chǎn)生病毒載體。 D D：病毒載體感染靶細胞，外源基因在細胞內(nèi)得以表達。病毒載體感染靶細胞，外源基因在細胞內(nèi)得以表達。3靶細胞的選擇 實際上講，無論何種細胞均具有接受外源DNA的才干，目前基因治療中制止運用生殖細胞作為靶細胞，而只能運用體細胞，用于轉(zhuǎn)基因的體細胞必需取材方便，含量豐富，容

52、易培育，壽命較長?？蛇x擇的細胞有淋巴細胞、造血細胞、上皮細胞、角質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、肝細胞、肌肉細胞和腫瘤細胞等。在實踐上運用中應(yīng)詳細根據(jù)目的條件選擇。 4細胞轉(zhuǎn)染tansfection 將目的基因?qū)氚屑毎姆椒ê芏啵笾驴煞譃槲锢韺W(xué)方法、化學(xué)方法、交融法和病毒感染法四類。病毒法已在本節(jié)的“基因的轉(zhuǎn)運中有基因引見。目前較多運用的是脂質(zhì)體法。 5外源基因的表達及檢測 在挑選出轉(zhuǎn)化分子后還需求鑒定轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中外源基因的表達情況。其中包括對目的基因和標(biāo)志基因表達的鑒定。常用方法有原位雜交，Northrn雜交，NRA打點雜交，免疫組織化學(xué)染色等，前幾項是檢測外源基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA，后者那么

53、是檢測外源基因翻譯出的蛋白質(zhì)。流式細胞儀是一種較為客觀準(zhǔn)確的儀器，可定量分析外源基因的表達情況。 4 基因治療的兩大途徑基因治療的兩大途徑基因治療的兩條主要途徑：即基因治療的兩條主要途徑：即 ex vivo 與與 in vivo 方式方式 ex vivo 途徑途徑 這主要是將含外源基因的載體在體外導(dǎo)入人體本身或異體這主要是將含外源基因的載體在體外導(dǎo)入人體本身或異體細胞，這種細胞被稱為細胞，這種細胞被稱為“基因工程化的細胞，經(jīng)體外細胞擴增后輸基因工程化的細胞，經(jīng)體外細胞擴增后輸回人體。這種方法易于操作，不易產(chǎn)生副作用，平安性好。但是，這回人體。這種方法易于操作，不易產(chǎn)生副作用，平安性好。但是，這

54、種方法不易構(gòu)成規(guī)模，而且必需有固定的臨床基地。種方法不易構(gòu)成規(guī)模，而且必需有固定的臨床基地。In vivo 這是將外源基因裝配于特定的真核細胞表達載體上，直接導(dǎo)入人這是將外源基因裝配于特定的真核細胞表達載體上，直接導(dǎo)入人體內(nèi)。這種方式非常有利于大規(guī)模工業(yè)化消費。但是，對這種方式導(dǎo)體內(nèi)。這種方式非常有利于大規(guī)模工業(yè)化消費。但是，對這種方式導(dǎo)入的治療基因以及其載體必需證明其平安性，而且導(dǎo)入人體之后必需入的治療基因以及其載體必需證明其平安性，而且導(dǎo)入人體之后必需能進入靶細胞，有效的表達并到達治療的目的。因此，在技術(shù)上要求能進入靶細胞，有效的表達并到達治療的目的。因此，在技術(shù)上要求很高，其難度明顯高于

55、上一種方式。很高，其難度明顯高于上一種方式。用于基因治療的病毒載體應(yīng)具備以下根本條件：用于基因治療的病毒載體應(yīng)具備以下根本條件：攜帶外源基因并能裝配成病毒顆粒；攜帶外源基因并能裝配成病毒顆粒；介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達；介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達；對機體沒有致病力。對機體沒有致病力。 由于大多數(shù)野生型病毒對機體都具有致病性，需求對其由于大多數(shù)野生型病毒對機體都具有致病性，需求對其進展改造后才干被用于人體。到目前為止，只需少數(shù)幾進展改造后才干被用于人體。到目前為止，只需少數(shù)幾種病毒如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒及腺病毒伴隨病毒、皰疹種病毒如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒及腺病毒伴隨病毒、皰疹病毒等被勝利的改呵斥為基因轉(zhuǎn)移載體。病毒等被勝利的改呵斥為基因轉(zhuǎn)移載體?；蛑委熤械膯栴}基因治療中的問題1 靶向性基因?qū)胂到y(tǒng)靶向性基因?qū)胂到y(tǒng) 基因治療中的關(guān)鍵問題基因治療中的關(guān)鍵問題是必需將治療基因送入特定的靶細胞，并在該是必需將治療基因送入特定的靶細胞，并在該細胞中得到高效的表達。細胞中得到高效的表達。2 外源基因表達的可控性外源基因表達的可控性 假設(shè)基因?qū)牒蟊磉_假設(shè)基因?qū)牒蟊磉_處于無調(diào)控的形狀，將會呵斥嚴重的后果。最處于無調(diào)控的形狀，將會呵斥嚴重的后果。最理想的可控性是模擬人體基因本身的調(diào)控方式。理想的可控性是模擬人體基因本身的調(diào)控方式。這將是今后長期的追求目的。這將是今后長期的追求