1、精選免疫細(xì)胞爭辯western blotWestern Blot常見問題及處理總結(jié)阿 木1、western blot 的優(yōu)點答： 靈敏，可達ng級，用Ecl顯色法理論上可達pg 級。便利，特異性高。2、為什么我的細(xì)胞提取液中沒有目標(biāo)蛋白？答： 緣由有很多: a) 你的細(xì)胞中不表達這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；b) 你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗體不能識別目標(biāo)蛋白，多看看說明，看是否有問題。3、我的細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？答： a) 有沉淀可能由于你的蛋白沒有變性完全，可以適當(dāng)提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長， b) 也不排解

2、你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。4、我做的蛋白質(zhì)分子量很小（10KD），請問怎么做WB？答：可以選擇0.2ml的膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。5、我的目的帶很弱，怎么加強？答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。6、膠片背景很臟，有什么解決方法？答：削減抗原上樣量，降低一抗?jié)舛?，轉(zhuǎn)變一抗孵育時間，提高牛奶濃度。7、目標(biāo)帶是空白，四周有背景，是為什么？答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反應(yīng)時間不長，將四周底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，?/p>

3、更換新底物。8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？答：假如能夠排解下面的幾個問題那么問題多半消滅在一抗和抗原制備上。a) 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；c) ECL底物沒掩蓋到相應(yīng)位置；d) 二抗失活。9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么緣由呢?答：a) 可能是紅燈造成的, 膠片原來就被曝光了，可以在完全黑暗的狀況下操作.看是否有改善.；b) 顯影時間過長。10、DAB好還是ECM好？答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECM結(jié)果簡潔把握，但被催化時靈敏度差一點，但假如達到閥值，就特殊靈敏，可以檢測pg

4、級抗原。要看你試驗的狀況。11、抗原檢測出的分子量比資料上的大，是怎么回事？答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么？答：可能是：a)樣品濃度過低；b)轉(zhuǎn)移時間不夠，。13、磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否肯定要加NaF等？答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。14、要驗證某個細(xì)胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？答： 免疫組化可以用來

5、進行定位，但是不能精確定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質(zhì)分子，進行定量，但是不能定位。 兩種試驗的一抗有時候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進行什么試驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。15、做Western Blot時，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開頭還有點痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120g，換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么緣由？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？答：懷疑是樣品問題，可能是：1，樣品不能反復(fù)凍融；2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot

6、過程， 提高一抗?jié)舛?。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。16、細(xì)胞水平要做western blot，多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot？答：一般5×106就足夠了17、同一樣品能同時提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響？答：能，沒有問題。18、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎？答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。19、假如目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要留意什么？答：假如是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫存得多，這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。20、我的樣

7、品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時經(jīng)常會發(fā)覺只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)覺有的孔全部的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么方法可以解決？答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉(zhuǎn)移時你可以用削減電流延長時間，加20甲醇。21、想分別的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE電泳的分別膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白簡潔作Western Blot嗎？答：200kd的蛋白不好做， 分別膠用7，積層膠 3.5。22、假如上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？答：可以濃縮樣品，也可以依據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30是不會有

8、問題的。假如已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。23、蛋白變性后可以存放多久？答：80，一兩年沒有問題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)。24、我所測定的蛋白分子量是105KD，按理說分別膠應(yīng)當(dāng)接受7.5%，但資料卻要求分別膠和濃縮膠均接受11的配方，不知為何？答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，由于105KD的蛋白在上述兩種膠的線性辨別范圍內(nèi)，但需留意條帶位置。25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知接受這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的

9、生成，是嗎？解答：不能使用脫脂奶粉，由于脫脂奶粉中含生物素，用代替應(yīng)當(dāng)好一點26、問一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關(guān)系嗎？答：Western Blot一般上樣30100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時間都有關(guān)系，也與顯色時間長短有關(guān)。開頭摸條件時，為了拿到陽性結(jié)果，各個步驟都可以量多一點時間長一點，當(dāng)然背景也就出來了。要拿到好的結(jié)果，假如抗體好的話比較簡潔，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。27、做組織樣品的western的時候，怎樣處理樣品？答：必需進行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好，離

10、心要充分，膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要留意抑制蛋白酶的活性（加入）。28、問大分子量蛋白200KD，在做western要留意什么呢？答：做200kd蛋白的Western Blot時要留意，分別膠最好選擇>7%的；剝膠時要當(dāng)心；轉(zhuǎn)移時間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則消滅雜帶不知道如何分析）。29、有什么方法可以提高上樣量？答：a)可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量；b)用5倍的上樣緩沖液來稀釋變性30、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？答：上樣量要依據(jù)試驗的要求來定， 假如要求是定量和半定量的Wes

11、tern Blot 則上樣量要均等，假如只是要定性，則沒有太大的關(guān)系， 盡量多上就行了， 但是不要超載.31、一抗，二抗的比例是否重要？答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。32、要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？答：對二抗無要求，要看你試驗條件來選擇，一般推舉用HRP標(biāo)記的二抗。33、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原打算簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，自然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消逝。假

12、如你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而假如抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。34、Western Blot 中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？答：抗體工作溶液一般不主見儲存反復(fù)使用，但是如抗體比較貴重，可反復(fù)使用23次。稀釋后應(yīng)在23天內(nèi)使用，4度保存，避開反復(fù)凍融。35、在做Western Blot時，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更簡潔跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。36、檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上

13、嗎？答：可以。37、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉(zhuǎn)膜好象不是很好，為什么？答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢， 你延長轉(zhuǎn)移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡。38、做Western Blot時，同樣的抗體免疫組化能做出，而Western Blot卻不能？答：這多半是抗體的問題，要看抗體的說明，是否能做Western Blot和免疫組化。39、假如是6×8轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗？答：一抗的稀釋度是有說明的，依據(jù)你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般最少為35ml。40、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達到最佳效果。答：無特殊要求。

14、但我們一般是上槽放新穎的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過一兩次的緩沖液41、跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什么緣由呢？是有的成分不對嗎？答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點水保持濕度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀看；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分別小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12SDS-PAGE， 濕轉(zhuǎn)120mA， 45-60min就可以了， 可以依據(jù)你試驗室的閱歷調(diào)整；170kd

15、用7%SDSPAGE，200mA 90-120min。43、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度），由于甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合力量，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）.44、我用的是可視marker，但是電泳總跑不全8條帶，請問什么緣由？怎樣改善？膠用過8，10，12，都是這樣。marker是新買的。答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或削

16、減電泳時間試試看。當(dāng)然梯度膠也是不錯的選擇。45、是否Western Blot試驗半定量肯定要加ACTIN內(nèi)參？答：對于發(fā)表文章的試驗最好加內(nèi)參，試驗嚴(yán)謹(jǐn)。46、核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適？答：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中的表達是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。47、做半定量Western Blot，內(nèi)參-actin，GAPDH哪個好？答：選用beta-actin就可以。48、想問一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)分嗎？答：一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非

17、有文獻特殊指明用特殊的方法，一般來說都沒有區(qū)分。49、轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”，其中TBST最終那個T是Tween嗎，濃度多大？答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), NaCl：8g， Tris base：2.42g 加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 調(diào)整pH 至 7.4, 加水定容至 1L.50、封閉，一抗，二抗時的溫度有沒有什么規(guī)定呢，比如在室溫里做，或者要在4度下?答：均可在室溫進行，假如時間不夠，一抗孵育可以先在室溫進行一個小時，然后4度過夜。51、請問一下PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，蛋白簡潔掉下來，結(jié)果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。52、怎樣