1、第六章微生物菌種的選育第一節(jié) 從自然界中分離篩選菌種1、生產(chǎn)菌株來源? 索取或購買? 自己選育用原有菌株進(jìn)行遺傳改造進(jìn)行育種向菌種保藏機構(gòu)索取、購買出發(fā)菌株進(jìn)行選從自然界中分離菌種從自然界中分離菌種就是從自然界微生物資源中有目的、快速、準(zhǔn)確地選出所需 要的菌種。從自然界中分離篩選菌種的一般步驟. 增殖培養(yǎng)（富集培養(yǎng)）? 適用：樣品中目的菌數(shù)量不夠多時? 目的：提高樣品中目的菌的數(shù)量和比例? 原理：通過控制營養(yǎng)成分或培養(yǎng)條件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生長受到抑制. 純種分離3、厭氧性微生物的分離法（ 1）去除培養(yǎng)基中的溶解氧，降低Eh（ 2）創(chuàng)造無氧環(huán)境物理除氧空氣置換法：干燥器或厭氧培

2、養(yǎng)罐化學(xué)除氧H2 + O2 - H2O 作巴作催化劑）GASPAK罐除氧：硼氫化鈉、檸檬酸，碳酸氫鈉化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生H2和CO2, H2與。2反應(yīng)生成水（ 3）厭氧分離（培養(yǎng)）技術(shù)高層瓊脂柱技術(shù)厭氧罐技術(shù)厭氧手套箱技術(shù)好氧培養(yǎng)五、培養(yǎng)工藝條件試驗與生產(chǎn)試驗1、搖瓶發(fā)酵條件培養(yǎng)基組成、初始pH、通風(fēng)量（裝液量）、接種量、培養(yǎng)溫度2、小型臺式發(fā)酵罐發(fā)酵工藝條件溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡劑 第二節(jié)基因突變突變（Mutation）定義：遺傳物質(zhì)核酸（DNA或病毒中的RNA ）的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突 然發(fā)生了可遺傳的變化。突變是一種遺傳的狀態(tài)，是基因由于結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而由原來的存在狀態(tài)變?yōu)榱硪环N

3、存在狀態(tài)，即它的等位基因。突變體：帶有突變基因的細(xì)胞或個體突變型：突變體的基因型或表型稱為突變型，和其相對的原存在狀態(tài)稱為野生型。一、 突變類型按變化范圍分突變類型（一）染色體畸變（chromosome aberration）染色體數(shù)目的變化或染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生較大片段的異常改變。1、染色體數(shù)目的變化? 整倍體（euploidy）:含有完整的染色體組?單倍體：haploid?二倍體：diploid?三倍體：triploid?四倍體：tetraploid 2、染色體結(jié)構(gòu)的變化?缺失deletion：?重復(fù)duplication：?倒位inversion：?易位translocation：（二 ） 基

4、因突變（gene mutation） 染色體局部座位內(nèi)的變化?點突變：只涉及DNA分子中一對或少數(shù)幾對堿基的改變。突變發(fā)生在一個基因范圍內(nèi)。? 多位點突變：突變超出一個基因范圍。1、堿基置換base replacementDNA鏈上的某一堿基對為另一堿基對所取代。? 轉(zhuǎn)換transition ：? 顛換transversion：2、移碼突變frameshift mutation ：由于一對或少數(shù)幾對（不是三的倍數(shù)）核苷酸的插入或缺失而造成此后一系列遺傳密碼子的閱讀框發(fā)生移位錯誤的突變。Phe Asp Glu Pro Leu Cys Thr5 -TTC GAT GAG CCC TTG TGC A

5、CG-3 J Insertion of APhe Asp Lys Thr Leu Val His5 -TTC GAT AAG ACC CTT GTG CAC G-3二、按表型效應(yīng)分突變類型? 野生型 wild type：表現(xiàn)該物種正常表型的生物。? 突變型 mutant:由于突變導(dǎo)致其正常的表型發(fā)生了改變的生物。? 形態(tài)突變型? 生化突變型? 營養(yǎng)缺陷型auxotrophic mutant? 抗性突變型resistant mutant3. 致死突變型4. 條件致死突變型5. 調(diào)節(jié)突變型三、基因突變的規(guī)律不對應(yīng)性或自發(fā)性、隨機性 、 稀有性、獨立性、穩(wěn)定性、可逆性、誘變性 、1、自發(fā)突變的證實隨

6、機性、不對應(yīng)性1）波動實驗2）涂布實驗3）影印培養(yǎng)實驗五、自發(fā)突變的機制環(huán) 境因素的影響微 生物自身產(chǎn)生的代謝物的影響轉(zhuǎn) 座子所造成的插入突變DNA 復(fù)制過程中偶爾發(fā)生錯誤六、誘變劑及其誘變機制誘變是指通過人為的方法，利用物理、化學(xué)因素處理微生物而引起的突變。（一 ） 物理誘變劑1）輻射：uv, x-射線丫-射線等效應(yīng)：點突變或染色體畸變機制：直接作用和間接作用間接作用：輻射作用于染色體外物質(zhì)，產(chǎn)生具有誘變作用的物質(zhì)；直接作用：輻射直接作用于染色體，2)熱：機理復(fù)雜?離子束 :能量傳遞、動量交換，離子沉積與電荷積累過程1、紫外線UV? 有效波長2650 ? ，紫外燈波長2537 ?作用機理喀咤

7、二聚體、喀咤水合物、交聯(lián)作用、DNA鏈斷裂? 效應(yīng)：移碼突變，堿基置換紫外線誘發(fā)胸苷二聚體(二 ) 化學(xué)誘變劑? 堿基類似物：是指其分子結(jié)構(gòu)同DNA分子中的堿基非常類似，因此能取代堿基參入到 DNA分子中的一類化合物。主要誘變劑：5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤；可誘發(fā)ATGC的轉(zhuǎn)換。2 . 移碼誘變劑嵌 入 DNA 分子相鄰堿基對之間，從而有利于核苷酸的環(huán)出，因此可提高移碼突變的突變率。主 要誘變劑：吖啶類化合物；溴化乙錠(ethidium bromide) ， ICR 系列化合物等部分移碼誘變劑DNA插入劑3 .化學(xué)修飾堿基的誘變劑1)烷化劑：使DNA分子的堿基發(fā)生烷化反應(yīng)，從而更容易發(fā)生錯配，

8、是最常用的一類誘變劑。常用的有：硫酸二乙酯(DES) ， 甲基磺酸乙酯(EMS) ， 亞硝基乙基尿(NEU), 亞硝基胍(NTG),乙烯亞胺(EI) 等。NTG (亞硝基胍)誘變作用特強，作用于復(fù)制叉，可誘發(fā)多基因并發(fā)突變，被稱為超誘變 劑。DNA 的脫嘌呤 烷化鳥嘌呤的堿基配對 烷化鳥嘌呤的交聯(lián)作用? 如甲基黃酸乙脂(EMS )使 G 的第6位烷化，使T 的第4位上烷化，結(jié)果產(chǎn)生的O-6-E-G 和 O-4-E-T 分別和T、 G配對，導(dǎo)致G C對轉(zhuǎn)換成A T對；T A對轉(zhuǎn)換成C G2)亞硝酸(introus acid, NA)有氧化脫氨作用，可使 G第2個碳原子上的氨脫去，產(chǎn)生黃喋吟（xa

9、nthine,x）,次黃喋吟 （H）仍和C配對，故不產(chǎn)生轉(zhuǎn)換突變。但C和A脫氨后分別產(chǎn)生U和次黃喋吟H,產(chǎn)生了轉(zhuǎn)換，使 C G轉(zhuǎn)換成A ：T, A T轉(zhuǎn)換成G C3）羥胺（NH2OH）只特異地和胞喀咤起反應(yīng)，在第4個C原子上加-OH,產(chǎn)生4-OH-C,此產(chǎn) 物可以和A配對，使C ： G專換成T ： A?作用：與C反應(yīng)，造成GC-AT轉(zhuǎn)換 七、DNA損傷的修復(fù)1、光復(fù)活作用photoreactivation2、切補修復(fù) excision repair （暗復(fù)活）第三節(jié)誘變育種一、誘變育種的一般步驟出發(fā)菌株J純化、活化、同步培養(yǎng)培養(yǎng)液J離心收集細(xì)胞、洗滌，制備均一的菌懸液（玻璃株打散、過濾）單細(xì)胞

10、或單孢子懸液J活菌計數(shù)，誘變預(yù)備試驗誘變處理J活細(xì)胞計數(shù)，致死率計算中間培養(yǎng)（后培養(yǎng)）平板分離J變異率計算初篩-> 復(fù)篩-> 保藏及擴大試驗（一）出發(fā)菌株的選擇1. 出發(fā)菌株的類型2. 對誘變劑的敏感性? 具有特定生產(chǎn)性狀的可能性：? 要盡量選擇單倍體，單核細(xì)胞（孢子）（二）菌懸液的制備? 細(xì)胞的生長狀態(tài)3. 菌懸液的均一性：4. 菌懸液細(xì)胞濃度酵母、霉菌孢子：106107個 /ml細(xì)菌、放線菌孢子：108個 /ml5. 菌懸液介質(zhì)：（三）誘變處理1. 誘變劑的選擇對于低產(chǎn)或野生菌，uv線往往是首選，烷化劑等也是常用的誘變劑；對于經(jīng)多次誘變處理的 菌株，常需要強輻射進(jìn)行處理。堿基置

11、換易回復(fù)，染色體畸變、移碼等不易回復(fù)細(xì)胞的透性和生理狀態(tài)經(jīng)常變換誘變劑或復(fù)合處理3 處理方法單一誘變劑處理;復(fù)合處理后培養(yǎng)目 的使突變基因純合并表達(dá)，消除表型延遲。后培養(yǎng)培養(yǎng)基：營養(yǎng)要求豐富，酪素水解液（或蛋白胨）可提供大量氨基酸，酵母膏可提供各種生長因子。五）變異菌株的分離及篩選 ? 篩選：包括初篩，復(fù)篩和終篩等。 ? 明確篩選目標(biāo)：產(chǎn)量突變還是其它突變型；產(chǎn)量準(zhǔn)備提高多少等； ? 一次誘變目標(biāo)不要太高 ? 制定篩選方案：篩選準(zhǔn)備分幾步；篩選采用的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件；每一步準(zhǔn)備篩選多少菌 株；每一步準(zhǔn)備采用的分析方法等。誘變育種工作中應(yīng)注意的問題安全問題：各種誘變劑幾乎都有致癌作用，因此在操

12、作中應(yīng)時刻注意安全問題：個人安全和環(huán)境安全。個人安全：操作時注意防護(hù)，不同誘變劑要求不同防護(hù)方法，如 丫-射線輻射防護(hù)要求較高,uv要求較低，而化學(xué)誘變劑則要求不與身體有關(guān)部位直接接觸；環(huán)境安全：所用物品要經(jīng)解毒處理；液體經(jīng)解毒或充分稀釋才可以排放。要養(yǎng)成良好的工作習(xí)慣：如仔細(xì)觀察細(xì)微的形態(tài)變化、要詳實記錄菌株的誘變史和誘變譜系。誘變育種技術(shù)要和其他育種手段相結(jié)合。誘變育種由于其篩選的盲目性，突變的不定向性，工作量十分大，因此要對整個工作進(jìn)行合理的設(shè)計并結(jié)合新技術(shù)提高其工作效率。二 、營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）突變株：是指喪失了合成一種或多種必需生長因子能力的菌株，

13、它們只能在補充了相應(yīng)的生長因子的培養(yǎng)基上才能正常生長。營養(yǎng)缺陷型突變株的用途科 研上：研究代謝途徑；基因重組的遺傳標(biāo)記菌種；AA、堿基、維生素生物測定的試驗菌種生 產(chǎn)上：發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸，核苷酸的生產(chǎn)菌種；生產(chǎn)菌株雜交育種的親本進(jìn)行遺傳標(biāo)記（一 ） 篩選方法后培養(yǎng)淘 汰野生型檢 出缺陷型鑒 定缺陷型1、淘汰野生型原理： 限制營養(yǎng)成分使缺陷型細(xì)胞生長受抑制，野生型細(xì)胞在生長過程中被殺死或生長后被除去方法：抗生素法：菌絲過濾法：適用于絲狀真菌差別殺菌：抗生素淘汰野生型饑餓培養(yǎng)：培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)離心、洗滌后，懸浮于無氮基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2小時，耗盡細(xì)胞內(nèi)氮源，防止加抗生素后的“誤殺 ”；加抗生素處理：加

14、入等體積的 2N基本培養(yǎng)基（兩倍濃度氮源的基本培養(yǎng)基），同時加入抗生素，培養(yǎng)一定時間，野生型細(xì)胞由于生長而被殺死，缺陷型細(xì)胞處于休止?fàn)顟B(tài)而得以保留。制霉菌素可用于處理酵母菌和霉菌。 注意：培養(yǎng)基應(yīng)添加滲透壓穩(wěn)定劑而制成高滲培養(yǎng)基，可避免由于細(xì)胞破裂而給缺陷型提 供營養(yǎng)物質(zhì)。2、檢出缺陷型1）限量補充法2）夾層培養(yǎng)法3）逐個檢出法4）影印培養(yǎng)法3、鑒定缺陷型生長譜法大類的鑒定：營養(yǎng)因子：A、酪素水解液（AA混合物）B、水溶性維生素混合液C、酵母核酸水解液（堿基）D 、酵母膏水溶液制備平板：缺陷型菌經(jīng) CM液體培養(yǎng)后，離心洗滌，制成 107108個/ml菌懸液。取0.1ml涂布至 MM 平板上MM

15、 上，適宜溫度下培養(yǎng)方法：分別用無菌小濾片沾取少許各種營養(yǎng)因子后，放入接種的判斷：A、D生長，AA缺陷型B、D生長，維生素缺陷型C、D生長，堿基缺陷型AB、D生長，AA、維生素雙缺AC、D生長，AA、堿基雙缺 BC、D生長，維生素、堿基雙缺營養(yǎng)缺陷型的生長譜鑒定不同類型突變株積累 L-賴氨酸的水平 其它類型突變型的篩選（一）抗代謝類似物突變型的篩選抗 反饋調(diào)節(jié)突變株： 是指一種對反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐缘慕M成型突變株，或兼而有之的突變株。代謝類似物：結(jié)構(gòu)與代謝物類似，因此可起到代謝物所具有的調(diào)節(jié)作用的一類化合物。1、抗反饋抑制突變發(fā) 生基因突變的細(xì)胞：酶的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變導(dǎo)致調(diào)節(jié)酶的調(diào)節(jié)部

16、位發(fā)生改變，不再與結(jié)構(gòu)類似物（或產(chǎn)物）結(jié)合，從而解除了產(chǎn)物的反饋抑制作用，使產(chǎn)物得以合成。突變前突變后抗 反 饋抑制突變的機制2、抗反饋阻遏突變型? 由于調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白不再能和輔阻遏物結(jié)合，或由于操縱基因發(fā)生突變，被激活的阻遏蛋白不能作用于已突變的操縱基因，從而解除產(chǎn)物的阻遏作用，使產(chǎn)物得以過量積累。3、篩選方法（ 1）將經(jīng)過誘變的細(xì)胞直接涂布在含有一定濃度結(jié)構(gòu)類似物的基本培養(yǎng)基平板上，長出的菌落即為抗結(jié)構(gòu)類似物突變株；（ 2）將經(jīng)過誘變的細(xì)胞涂布在基本培養(yǎng)基平板上，在平板的中央加少量結(jié)構(gòu)類似物，在抑菌圈內(nèi)長出的個別菌落即為抗結(jié)構(gòu)類似物突變株；注意：? 如果是協(xié)同反饋抑制，

17、則要在基本培養(yǎng)基中添加起協(xié)同反饋抑制作用的產(chǎn)物? 抗結(jié)構(gòu)類似物突變是數(shù)量性狀，可通過逐漸提高結(jié)構(gòu)類似物的濃度使產(chǎn)物的積累水平逐漸提高結(jié)構(gòu)類似物和代謝終產(chǎn)物（二）組成型酶突變株的篩選1、誘導(dǎo)型酶在生產(chǎn)上的缺點誘導(dǎo)物往往價格昂貴受誘導(dǎo)物種類，濃度及分解產(chǎn)物的影響2、篩選原理通過誘變處理，使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，不產(chǎn)生有活性的阻遏蛋白，或者操縱基因發(fā)生突變不再能與阻遏物相結(jié)合，從而使誘導(dǎo)型酶變?yōu)榻M成型酶。3、篩選方法創(chuàng)造一種有利于組成型菌株生長而不利于誘導(dǎo)型菌株生長的培養(yǎng)條件，造成對組成型的選擇優(yōu)勢或者適當(dāng)?shù)淖R別兩類菌落的方法，從而把組成型突變株選擇出來。恒化器法以誘導(dǎo)物作底物，濃度低于起誘導(dǎo)作用濃度，

18、誘導(dǎo)型菌株生長極弱，而變異株由于能產(chǎn)分解底物的酶，則能分解底物而得以生長，通過連續(xù)不斷加入新鮮基質(zhì)，使變異株數(shù)量逐漸增多，最后達(dá)到能分離的濃度。循環(huán)培養(yǎng)法不含誘導(dǎo)物培養(yǎng)基? 含誘導(dǎo)物培養(yǎng)基（普通碳源或氮源）（誘導(dǎo)物作唯一碳源或氮源）（三）細(xì)胞膜透性突變型1、提高細(xì)胞膜透性的優(yōu)點? 使胞內(nèi)產(chǎn)物濃度維持較低的水平，有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，提高產(chǎn)物的生成量?使胞內(nèi)產(chǎn)物濃度維持低于發(fā)生反饋抑制或阻遏的程度，以積累過量的產(chǎn)物2、提高細(xì)胞膜透性的措施第四節(jié) 基因重組遺傳重組的一般概念遺傳重組（基因重組）：遺傳重組是指遺傳物質(zhì)從一個細(xì)胞向另一個細(xì)胞傳遞并導(dǎo)致DNA交換和重排的過程。遺傳改造的手段包括基因突變和

19、基因重組微生物中基因重組的方式：?真核微生物：有性生殖和準(zhǔn)性生殖；?原核微生物：接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)一、細(xì)菌的轉(zhuǎn)化定義：受體細(xì)胞直接吸收裸露的外源DNA并與其自身遺傳物質(zhì)發(fā)生重組，從而使受體細(xì)胞獲得共體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象。1、轉(zhuǎn)化過程?感受態(tài)受體細(xì)胞?轉(zhuǎn)化因子的吸附和吸收?轉(zhuǎn)化因子的整合及轉(zhuǎn)化子的形成二、轉(zhuǎn)導(dǎo)Transduction通過噬菌體作為媒介，而把一個細(xì)菌的基因?qū)肓硪粋€細(xì)菌的過程叫轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)的組分：供體細(xì)菌，受體細(xì)菌，轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體（一）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo) specialized transduction只能傳遞供體染色體上原噬菌體整合位點附近的少數(shù)固定基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。1、轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成? Cam

20、pbell模型（不正確切離）?形成頻率：10-62、轉(zhuǎn)導(dǎo)子的形成?穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子的獲得雙交換?不穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子的獲得一一溶原化(二)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)generalized transduction? 能傳遞供體的任何基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。1、轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成? 選擇性包裹模型? 形成頻率：10-62、轉(zhuǎn)導(dǎo)子的形成? 完全轉(zhuǎn)導(dǎo)與完全轉(zhuǎn)導(dǎo)子Complete transduction通過雙交換而實現(xiàn)約占 1/10? 流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)與流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)子Abortive transduction進(jìn)入受體的供體DNA片段既不復(fù)制，也不整合，但能正常表達(dá)。3、共轉(zhuǎn)導(dǎo)cotransduction? 由一個轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體同時傳遞兩個供體基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。?

21、共轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率3、 細(xì)菌的接合? 供體細(xì)胞和受體細(xì)胞直接接觸后，質(zhì)粒從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程。Conjugation is the mechanism by which genetic material is transferred between two cells by plasmids.1) F- 、 F+、Hfr 菌株F +菌株Hfr 菌株F - 菌株2、細(xì)菌接合作用2) ) F + XF-結(jié)果：F-轉(zhuǎn)變?yōu)镕+3) ) Hfr X F-Hfr DNA 的轉(zhuǎn)移4) F 因子轉(zhuǎn)導(dǎo)? F'因子：帶有細(xì)菌基因的 F因子。例F-lac, F-gal, F-pro? F'因子的

22、形成：Hfr菌株中F因子的異常切除(aberrant excision)?F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)(性因子轉(zhuǎn)導(dǎo)、性導(dǎo))通過F 因子的轉(zhuǎn)移而使受體細(xì)菌改變其遺傳性狀的現(xiàn)象4、 真菌的有性生殖Sexual reproduction一、真菌有性生殖過程二、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa )的生活史5、 真菌的準(zhǔn)性生殖Parasexual reproduction? 能進(jìn)行準(zhǔn)性生殖的微生物：Aspergillus nidulans; Asp. niger; Asp. sojaePenicillium chrysogenum; Fusarium oxysporum(一)準(zhǔn)性生殖的過程異核體形成；(雜合

23、)二倍體形成；體細(xì)胞交換和單元化1、異核體的形成? 異核體細(xì)胞：并存有兩個不同遺傳性狀的核的細(xì)胞? 異核體菌絲體：由異核體細(xì)胞構(gòu)成的菌絲體? 異核體的無性繁殖：產(chǎn)生親代類型的單倍體分生孢子? 異核體的生物學(xué)意義：具有生長優(yōu)勢；可以儲備隱性突變2、異核體的形成(1) 選擇親本A. 親緣關(guān)系近B. 生活力、產(chǎn)生分生孢子的能力及數(shù)量相似C. 帶不同的遺傳標(biāo)記(2) 創(chuàng)造形成異核體的條件A. 限制性培養(yǎng)基B. 孢子混合數(shù)量：106108(二)雜合二倍體的形成1、形成：將106 107個異核體的分生孢子涂至MM 上，長出的少數(shù)菌落即為二倍體2、檢出：避免異核體分生孢子重新形成異核體的措施? MM 要十分

24、純正? 采用具有分生孢子顏色突變型和營養(yǎng)缺陷型作遺傳標(biāo)記（三）有絲分裂分離二倍體在有絲分裂過程中發(fā)生基因重組，使隱性基因得以表達(dá)，由此產(chǎn)生各種類型的分離 子。1、體細(xì)胞交換與體細(xì)胞重組體（ 1）體細(xì)胞交換：在有絲分裂過程中同源染色體發(fā)生的交換。由此導(dǎo)致部分基因的純合化。2、單元化過程與非整倍體及單倍體分離子單元化過程：是在一系列有絲分裂過程中發(fā)生的染色體不離開行為的結(jié)果。有性生殖與準(zhǔn)性生殖的區(qū)別六、原生質(zhì)體融合技術(shù)1、原生質(zhì)體融合育種的優(yōu)勢：? 基因重組頻率提高? 重組的親本范圍擴大? 融合子集中兩親本優(yōu)良性狀的機會增大（一）原生質(zhì)體融合技術(shù)的一般步驟融合親本的選擇與標(biāo)記； 原生質(zhì)體的制備；

25、原生質(zhì)體的融合； 原生質(zhì)體的再生； 融合子的選擇與鑒定； 目標(biāo)菌株的篩選。七、基因工程育種Genetic engineering重組 DNA 技術(shù)：recombinant DNA technology基因工程是將不同生物的基因在體外人工剪切組合并和載體（質(zhì)粒、噬菌體、病毒）DNA連接，然后轉(zhuǎn)入微生物或細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行擴增，并使轉(zhuǎn)入的基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生 所需要的蛋白質(zhì)。一、目的基因的獲得主要方法? 化學(xué)合成? PCR擴增?從DNA文庫中篩選1、 PCR 體外擴增目的基因Polymerase Chain Reaction 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)? 一種體外DNA擴增技術(shù)，用于擴增位于兩端已知序列之間的DN

26、A區(qū)段(靶序列)?在DNA聚合酶催化下，通過兩條人工合成的單鏈引物的引導(dǎo)而擴增模板DNA片段的方法(1)基本PCR組成：? 含目標(biāo) DNA 序列的模板DNA (Template)? 寡核苷酸引物( Primers)：界定復(fù)制范圍兩端的引物? DNA 聚合酶 ： (Taq. Polymearse)? DNA合成底物及水：dNTPs(2) PCR反應(yīng)一一三個主要步驟? 變性 ( denaturation)： 90以上? 退火 ( annealing)： 5065 ? 延伸 (extension)： 72 2030 個循環(huán)2、 基因文庫法(1)從共體菌基因組DNA獲取目的基因DNA文庫： 生物染色體基因組各 DNA片段的克隆總體。? 分離染色體DNA? 用限制性酶部分水解?分離選出一定大小合適克隆的 DNA片段基因文庫構(gòu)建步驟? 提取 DNA? 酶解? 電泳分離? 與載體連接? 導(dǎo)入宿主? 篩選陽性克隆 二 、 優(yōu)良載體的選擇? 優(yōu)良載體應(yīng)具備的特點?又E.coli受體細(xì)胞，載體有質(zhì)粒載體、入噬菌體載體、柯斯質(zhì)粒載體三、目的基因與載體 DNA