1、子學習情境4 青霉素發(fā)酵任務一 青霉素的結構和理化性質一、 -內酰胺類抗生素特性和作用機制1. 結構特性都含有一個四元的內酰氨環(huán)，并通過N與相鄰的碳原子和另外一個雜環(huán)相稠合。2. 物理性質白色或黃色無定型或結晶性固體。熔點不明顯，具有旋光，酸性形式易溶于有機溶劑，鹽易溶于極性溶劑，特別是水。3. 化學性質化學性質活潑，由于稠環(huán)的作用，青霉素的內酰胺環(huán)很易開環(huán)，頭孢菌素相對穩(wěn)定。4. 作用機制通過抑制肽聚糖轉肽酶及D-丙氨酸羧肽酶的活性抑制肽聚糖的合成，從而干擾細胞壁的合成。二 發(fā)展概況1929 Fleming 首先發(fā)現(xiàn)青霉素可抑制葡球菌的生長，但并未獲得足夠重視1940 Florey Chai

2、n青霉菌發(fā)酵液中提取出了青霉素1945 意大利 Brotzu 發(fā)現(xiàn)頭孢菌素C1958后 人工合成半合成青霉素、頭孢菌素陸續(xù)發(fā)現(xiàn)頭霉素、克拉維酸、硫霉素、單環(huán)-內酰胺三 常用的-內酰胺類抗生素（一）青霉素：芐青霉素、青霉素V、氨芐西林、替卡西林、甲氧西林、氯唑西林(一) 頭孢菌素頭孢菌素C、頭霉素C、頭孢力行、頭孢克洛、頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢他啶（一） 新型-內酰胺四、天然存在的青霉素青霉素是一族化合物的總稱。分子式：R為側鏈，根據(jù)R基不同青霉素G C6H5CH2-青霉素X HOC6H4CH2-青霉素F CH3CH2CH=CHCH2-青霉素K CH3(CH2)6-雙氫青霉素F CH3(CH2)

3、4-青霉素V C6H5OCH2-五、青霉素的理化性質（一）穩(wěn)定性干燥純凈的青霉素鹽很穩(wěn)定，有效期都在三年以上，并且對熱穩(wěn)定，如結晶青霉素鉀鹽在150OC加熱1.5小時效價不降低。青霉素水溶液PH=5-7較穩(wěn)定。最穩(wěn)定的PH為6-6.5。（一） 溶解度青霉素在水中溶解度小，易溶于有機溶劑青霉素鹽易溶于水、甲醇（二） 降解反應青霉素遇酸、堿、加熱易開環(huán)，倒是抗菌活性喪失。詳見課本（三） 紫外吸收光譜在252nm 257nm 264nm具有弱的吸收峰（四） 過敏反應任務二 發(fā)酵法工藝過程現(xiàn)代抗生素生產(chǎn)絕大多數(shù)采用發(fā)酵法生產(chǎn)，雖然種類繁多，但其基本過程大致相同。菌種孢子制備種子制備發(fā)酵發(fā)酵液的預處理及

4、過濾提取及精制成品檢驗成品包裝出廠檢驗。一般說，從孢子制備到發(fā)酵屬于“生物合成”范圍從預處理到提取精制屬于化工范圍一 生產(chǎn)菌種菌種是發(fā)酵生產(chǎn)的基礎，必須產(chǎn)量高、性能穩(wěn)定、容易培養(yǎng)。為防止菌種衰退，要合理保藏。一般保存在沙土管或冷凍于干燥管中。一般使用期為年，不斷純化淘汰變異菌種。有條件的可以菌種選育，不斷提高產(chǎn)量。二、 孢子制備孢子制備是發(fā)酵工序的開端，孢子的質量、數(shù)量對以后菌絲體的生長繁殖有很大的影響。不同菌種的孢子制備工藝是不同的。（一）.放線菌類培養(yǎng)基：人工合成固體培養(yǎng)基，C源N源不要太豐富。以利于產(chǎn)生大量孢子溫度：大多28 土 1CO 部分菌種30 CO或者37時間：（因菌種不同而異）

5、一般4-7天保存：2-4 CO冰箱保存一周左右放線菌發(fā)酵生產(chǎn)的工藝過程如下：采用哪一代的斜面孢子接入液體培養(yǎng)，視菌種特性而定。采用母斜面孢子接人液體培養(yǎng)基有利于防止菌種變異，采用子斜面孢子接入液體培養(yǎng)基可節(jié)約菌種用量。菌種進入種子罐有兩種方法。一種為孢子進罐法，即將斜面孢子制成孢子懸浮液直接接人種子罐。此方法可減少批與批之間的差異，具有操作方便、工藝過程簡單、便于控制孢子質量籌優(yōu)點，孢子進罐法已成為發(fā)酵生產(chǎn)的一個方向。另一種方法為搖瓶菌絲進罐法，適用于某些生長發(fā)育緩慢的放線菌，此方法的優(yōu)點是可以縮短種子在種子罐內的培養(yǎng)時間。（二）.霉菌類培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基（大米、小米、麥麩）工藝過程：沙土管-

6、斜面-親米-生產(chǎn)米-種子罐首先將保存于沙土管中或冷凍管中的菌種孢子接種在斜面上，恒溫培養(yǎng)，孢子成熟后制作成孢子懸浮液然后接種到大米或小米等培養(yǎng)基上，恒溫成熟后稱為“親米”，由親米再轉至大米或小米培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成熟后稱為“生產(chǎn)米”，用生產(chǎn)米介入種子罐內，培養(yǎng)溫度一般為25-28度，培養(yǎng)時間一般為4-14天。（三）.細菌類培養(yǎng)溫度：37CO 少數(shù)為28 CO培養(yǎng)時間：多數(shù)1-2天 有的芽孢需要5-6天，甚至十多天（四）影響孢子質量的因素及其控制1、原材料質量的影響多數(shù)抗生素產(chǎn)生菌對原材料敏感。如：四環(huán)素斜面孢子與小麥麩皮質量關系密切，小麥的產(chǎn)地、品種、加工方法、成份用量對孢子質量均有影響。青霉素的

7、大米孢子，由于大米產(chǎn)地、顆粒大小、均勻程度不同如：瓊脂的牌號不同對孢子的質量也有影響。原因是不同的瓊脂含有不同的無機離子。如：水質。污染，硬度大。人工調節(jié)2、.培養(yǎng)條件的影響1.溫度：如：鏈霉素（灰色鏈霉菌）斜面孢子，在26.527.5 CO正常生長，超過28就不能正常生長。土霉素產(chǎn)生菌在36.5-37 CO，超過37CO，孢子早熟易老化2.相對濕度北方控制在40-45%，南方控制在35-42%（三）冷藏時間的影響總的原則是易短不易長，一般不超過7天。（四）孢子齡及孢子量的影響過于年輕的孢子經(jīng)不起冷藏，過于衰老的孢子生產(chǎn)能力下降，控制在孢子成熟、孢子量多、效價正常時為宜。孢子量過多或過少，對發(fā)

8、酵也是不利的。小結：本節(jié)介紹了青霉素的結構和作用機理。介紹了發(fā)酵生產(chǎn)抗生素的菌種制備過程和孢子培養(yǎng)過程。三、種子制備種子制備是將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的孢子或菌體轉入到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其繁殖成大量菌絲或菌體的過程。(一)搖瓶種子制備某些孢子發(fā)芽和菌絲繁殖速度緩慢的菌種，需將孢子經(jīng)搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再進人種子罐，這就是搖瓶種子。目的就是讓孢子發(fā)芽長成健壯的菌絲。搖瓶種子進罐，常采用母瓶、子瓶兩級培養(yǎng)，有時母瓶種子也可以直接進罐。培養(yǎng)基：其培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件與種子罐相似，要求比較豐富和完全，易被菌體分解利用，氮源豐富有利于菌絲生長。原則上各種營養(yǎng)成分不宜過濃，子瓶培養(yǎng)基濃度比母瓶略高，更接近種子罐

9、的培養(yǎng)基配方。（二）種子罐種子制備孢子懸浮液或搖瓶種子接入種子罐后，在罐內繁殖成為大量菌絲的過程，從而縮短了發(fā)酵罐繁殖菌絲的時間，增加了抗生素合成時間。1 種子罐級數(shù)因抗生素品種不同，可分為一級種子、二級種子、三級種子。a一級種子（二級發(fā)酵）：將孢子或搖瓶種子接種到體積較小的種子罐中，培養(yǎng)繁殖成為大量菌絲體，然后接種到發(fā)酵罐發(fā)酵。這樣的種子稱為一級種子，利用一級種子進行發(fā)酵的過程稱為二級發(fā)酵。如：青霉素、四環(huán)素、頭孢菌素b二級種子（三級發(fā)酵）將制備的一級種子接入體積較大的種子罐，培養(yǎng)繁殖更多的菌絲，然后轉入發(fā)酵罐發(fā)酵。如：紅霉素、卡那霉素、慶大霉素c.三級種子（司級發(fā)酵）如：鏈霉素2.種子罐級

10、數(shù)的確定根據(jù)菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度，以及所采用發(fā)酵罐的容積而定。生長快的細菌，種子用量比例少，種子罐相應也少，生長慢的菌種種子罐級數(shù)要多。種子罐的級數(shù)越少，越有利于簡化工藝，并可減少染菌機會。改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應地減少種子罐的級數(shù)。3.接種齡和接種量a.接種齡接種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。接種齡以菌絲體處于生命力極為旺盛的對數(shù)生長期，且培養(yǎng)液中菌體量還未達到最高峰時，較為合適。過于年輕的種子會出現(xiàn)前期生長緩慢、發(fā)酵周期延長、產(chǎn)物開始形成的時間推遲，甚至會因菌絲量過少而在發(fā)酵罐內結球，造成異常發(fā)酵。過老

11、的種子會引起生產(chǎn)能力下降而菌絲過早自溶。嗜堿性芽孢桿菌產(chǎn)生堿性蛋白酶的接種齡試驗情況，以12h為接種齡所得的酶活力最高。接種量 接種量是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。大多數(shù)抗生素最適接種量為7%15%，有時可增加到20%25%接種量的大小取決于菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度。采用較大的接種量可以縮短菌絲繁殖時間，使抗生素的形成提前到來。但是，如果接種量過多，往往使菌絲生長過快，培養(yǎng)液黏度增加，造成溶解氧不足，影響產(chǎn)物的合成。如：嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶1%接種量產(chǎn)酶活力最高，在0.5%4%接種量之間雖有差別，但影響不大，一旦超過4%則產(chǎn)量明顯下降。(三)、影響種子質量的因素及其

12、控制種子質量主要受孢子質量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種齡和接種量等因素的影響。1.培養(yǎng)基a營養(yǎng)成分豐富培養(yǎng)基營養(yǎng)成分應適合種子培養(yǎng)的需要，易于被菌體吸收和利用氮源和維生素含量較高，可使菌絲粗壯并具有較強的活力。b.盡量與發(fā)酵罐接近要盡可能地和發(fā)酵培養(yǎng)基接近，入罐后容易適應發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件。c.要略稀薄發(fā)酵培養(yǎng)基一般比較濃，而種子培養(yǎng)基以略稀薄為宜。d.pH值要比較穩(wěn)定pH值的變化會引起各種酶活力的改變，對菌絲形態(tài)和代謝途徑影響很大。2培養(yǎng)條件a.溫度種子培養(yǎng)應選擇最適溫度。b.通氣攪拌培養(yǎng)過程中通氣攪拌的控制很重要，各個不同時期的需氧量不同，一般前期需氧量較少。后期需氧量較多。在青霉素生產(chǎn)的種子制備

13、過程中，充足的通氣量可以提高種子質量。例如，將通氣充足和通氣不足兩種情況下得到的種子都接入發(fā)酵罐內，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。通氣攪拌不足可引起菌絲結團、菌絲粘壁等異?，F(xiàn)象。c.消泡生產(chǎn)過程中，有時種子培養(yǎng)會產(chǎn)生大量泡沫而影響正常的通氣攪拌，此時應嚴格控制，甚至可考慮改變培養(yǎng)基配方，以減少發(fā)泡。d.補料在種子罐培養(yǎng)一定時間后，補入一定量的種子培養(yǎng)基，結果種子質量有所提高，菌絲團明顯減少，菌絲粗壯，發(fā)酵單位增高。3.種子異常分析在生產(chǎn)過程中，種子質量受各種各樣因素的影響，種子異常的情況時有發(fā)生，會給發(fā)酵帶來很大的困難。種子異常往往表現(xiàn)為菌種生長發(fā)育緩慢或過快、菌絲結團、菌絲粘壁三個方面。a菌種生

14、長發(fā)育過快或過慢菌種在種子罐生長發(fā)育緩慢或過快和孢子質量以及種子罐的培養(yǎng)條件有關。生產(chǎn)中，通入種子罐的無菌空氣的溫度較低或者培養(yǎng)基的滅菌質量較差是種子生長、代謝緩慢的主要原因。生產(chǎn)中，培養(yǎng)基滅菌后需取樣測定其pH值，以判斷培養(yǎng)基的滅菌質量。b菌絲結團在液體培養(yǎng)條件下，繁殖的菌絲并不分散舒展而聚成團狀稱為菌絲團。這時從培養(yǎng)液的外觀就能看見白色的小顆粒，菌絲聚集成團會影響菌的呼吸和對營養(yǎng)物質的吸收。如果種子液中的菌絲團較少，進入發(fā)酵罐后，在良好的條件下，可以逐漸消失，不會對發(fā)酵產(chǎn)生顯著影響。如果菌絲團較多，種子液移入發(fā)酵罐后往往形成更多的菌絲團，影響發(fā)酵的正常進行。菌絲結團與攪拌效果差、接種量小有

15、關，一個菌絲團可由一個孢子生長發(fā)育而來，也可由多個菌絲體聚集一起逐漸形成。c菌絲粘壁菌絲粘壁是指在種子培養(yǎng)過程中，由于攪拌效果不好，泡沫過多以及種子罐裝料系數(shù)過小等原因，使菌絲逐步粘在罐壁上。其結果使培養(yǎng)液中菌絲濃度減少，最后就可能形成菌絲團。以真菌為產(chǎn)生菌的種子培養(yǎng)過程中，發(fā)生菌絲粘壁的機會較多。四、 發(fā)酵過程的控制（一） 溫度變化及其控制1、溫度對發(fā)酵的影響溫度影響微生物的生長發(fā)育和代謝活動。因為一切代謝活動都依賴于酶。而酶的活力只有在最適才能發(fā)揮。溫度低于最適范圍，菌體生長緩慢；高于最適范圍，酶易過熱失活，使菌體自溶，發(fā)酵周期縮短，影響抗生素產(chǎn)量。發(fā)酵最適溫度低于最適生長溫度幾度。如：產(chǎn)

16、黃青霉菌最適溫度為27-28OC,分泌青霉素的最適溫度為26 OC小單胞菌34-36 OC,分泌慶大霉素32-34 OC溫度不僅影響菌體生長與合成速度，甚至影響合成方向例如， <30 OC 金霉素金色鏈霉菌 >35 OC 四環(huán)素2、發(fā)酵最適溫度的選擇 所謂最適溫度是指最適于產(chǎn)生菌生長或合成抗生素的溫度。注意：a.抗生素在發(fā)酵周期內一般不能只選擇一個最適溫度?！榜R克思主義矛盾論”例如，青霉素產(chǎn)生菌生長最適溫度為30，但產(chǎn)生青霉素的最適合成溫度是24.7。在生長初期，抗生素還未開始合成，以促進菌絲體生長繁殖為目的，應該選擇最適生長溫度；當菌絲濃度達到一定程度，到了抗生素分泌時，生物合成

17、成為主要方面，就應該滿足生物合成的最適宜溫度。如：發(fā)酵前期保持在28，40h之后改為27-27.5，放罐前24h，在增加到28，鏈霉素產(chǎn)量明顯增加。b.發(fā)酵溫度的選擇還需參考其他發(fā)酵條件靈活掌握如：通氣條件較差，一般溫度較低為宜。因為溫度較低可以相應增加氧的溶解度，菌絲生長速度也可減慢，從而彌補發(fā)酵供氧不足。 (二) PH的影響及控制 酶活力 PH抗生素產(chǎn)生菌的最適PH一般在5-8，但是不同菌種的PH也不一樣。了解了菌種的PH范圍，就要進一步調節(jié)，方法如下：1. 根據(jù)菌種特性和培養(yǎng)基性質，選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)基成分和配比，有些成分可以中間補料時補充調節(jié).如：青霉素發(fā)酵中，根據(jù)青霉素產(chǎn)生菌的代謝需要，

18、用改變加糖率來控制PH比固定加糖率通過加酸、堿調節(jié)PH可以提高產(chǎn)量25%2.加入適當?shù)木彌_劑，以控制培養(yǎng)基PH的變化。常用的緩沖劑是碳酸鈣和磷酸鈣。其中碳酸鈣便宜，方便、效果好。主要作用是中和各種酸，防止PH急劇下降。3.在發(fā)酵過程中出現(xiàn)PH過高和過低時，可以直接用酸堿調節(jié)。（三） 通氣與攪拌1、通氣攪拌對抗生素發(fā)酵的影響一般情況下，產(chǎn)生菌在發(fā)酵過程中的需氧量為20-25毫克分子/升.小時，氧在發(fā)酵液中的溶解度為1個大氣壓下0.2毫克分子/升，隨溶質濃度升高溶解度度還會下降，如果不及時通氧，微生物只能維持正常呼吸15-30秒，然后呼吸就收到了抑制，遠遠不能滿足發(fā)酵菌的需要。因此需要通入無菌空氣

19、，并且通過攪拌與培養(yǎng)既充分混合，增加通氣效果。發(fā)酵產(chǎn)生菌對氧的需求量取決于下列兩個因素：單位體積培養(yǎng)液中菌的濃度和軍的呼吸強度（單位重量菌絲體在單位時間內的好氧量Qo2 ）幼齡菌呼吸強度最大，隨菌齡增長稍微下降，然后急劇下降。發(fā)酵前期：早期菌量少，需氧量不大，進入對數(shù)生長期，菌絲濃度急劇增加，呼吸極為旺盛。達到最高。發(fā)酵中期：細菌生長穩(wěn)定抗生素開始合成，呼吸強度減弱，為繼續(xù)維持細胞活動和抗生素的合成，通氣攪拌還須保持在一定水平。發(fā)酵后期：菌絲逐漸趨向自溶，可適當降低空氣流量或降低攪拌轉速。2、影響發(fā)酵過程中供養(yǎng)的因素a.生產(chǎn)菌種不同品種的抗生素產(chǎn)生菌對氧的需求是不同的。如：青霉素 80最大攝氧

20、率40毫克分子/升.小時鏈霉素 12h 45四環(huán)素 12h 37制霉菌素 73h 25灰黃霉素 24h 8新霉素 138h 16b.培養(yǎng)基增加培養(yǎng)基成分的濃度，可是產(chǎn)生菌的攝氧率增加。如：鏈霉素大罐發(fā)酵70h后補糖，補前攝氧率34.3毫克分子/升.小時，補后78h為40.9毫克分子/升.小時。c.菌絲濃度菌絲濃度大，需氧量就越高。d.種子的質和量接種量大，生長快，菌絲濃度高，需氧就多。年輕菌絲呼吸強度較高。e.泡沫和消沫劑使用動植物油脂作為消沫劑有利于溶氧。f.其他因素有毒產(chǎn)物的積累，如CO2不及時排出對溶氧是不利的。3.影響發(fā)酵過程中供氧的因素a.攪拌攪拌改善通氣的機理不利方面：耗能、影響某

21、些微生物的菌絲形態(tài)，功率過高時甚至會造成細胞損傷。b.空氣流速空氣流速能影響通氣效率，通氣效率隨空氣量的增加而增加。隨著空氣流速的增大，大氣泡造成發(fā)酵液更大的湍流，空氣流速過大能使攪拌葉輪發(fā)生過載，即葉輪不能分散空氣，此時氣流形成大氣泡在軸的周圍溢出，因此當空氣流速超過過載速度后，通氣效率不再增加。c.發(fā)酵液的物理性質軍體本身的代謝和繁殖會影響到發(fā)酵液的物理性質，比如表面張力、黏度、離子濃度，而這些變化會影響到氣體的溶解度顯著影響通氣效率。(四) 發(fā)酵過程中的代謝與控制發(fā)酵過程應及時掌握產(chǎn)生菌生長代謝、培養(yǎng)基的性質含量等狀況，所以必須進行發(fā)酵過程中的中間分析。1、中間分析項目分析項目：抗生素效

22、價、Ph值、糖含量、氨基氮和氨氮、磷濃度、菌絲濃度、黏度。a抗生素效價單位一般采用化學測定法和生物測定法。（1）.化學測定法以抗生素化學結構為基礎，通過一定的化學反應進行測定。優(yōu)：簡單迅速，可在較短的時間內得到結果。缺：準確度差，易受雜質和類似化合物的干擾。（2）.生物測定法以抗生素的抑菌和殺菌作用為基礎。方法復雜，需要無菌操作，且有操作和生物誤差。此法在中間測定一般不采用。大多用于放罐樣品和出廠成品的檢驗。b.PHPH試紙、酸度計c.糖含量(1).總糖是指發(fā)酵液中各種糖的總量，它是分析及計算發(fā)酵過程中湯消耗的主要數(shù)據(jù)。方法：把含糖的發(fā)酵液用酸水解，使多糖和雙塘變成G,然后測定其還原糖的總含量

23、。（2）.還原糖是發(fā)酵液中含有醛基的單糖，通常指G。因為葡萄糖能直接被微生物利用，參與發(fā)酵代謝及抗生素的合成，因此還原糖的變壓可以直接反映產(chǎn)生菌的代謝狀況。克/100mld.氨基氮和氨氮氮源物質的變化也反映發(fā)酵菌的生長狀況，生產(chǎn)商一般測定氨基氮（NH2-N）和氨氮(NH3-N).這兩種形式都可以用甲醛法測定。毫克/100毫升 微克/毫升e磷含量微生物代謝活動對磷的要求很高。磷的供應以磷酸鹽為主，以有機磷為輔。f.菌絲濃度和黏度菌絲濃度，單位體積發(fā)酵液中的菌絲數(shù)量。粘度的測定可以用旋轉式粘度計，單位為厘泊。發(fā)酵液的黏度由1厘泊到500厘泊不等。簡單方法：用一根0.5米長直徑0.8cm的玻璃管，吸

24、取一定量的發(fā)酵液，用馬表記錄其留出速度2. 中間補料與代謝控制a.中間部料的意義與原則中間補料：在發(fā)酵過程中補充某些營養(yǎng)物料，以滿足產(chǎn)生菌在培養(yǎng)過程中，特別是中期的生化代謝活動和合成抗生素的需要。原則：控制和引導抗生素產(chǎn)生菌在培養(yǎng)過程中，特別是中期的色花代謝活動，使其向著有利于抗生素合成和分泌的方向進行。 意義：1.控制中期代謝 2.延長抗生素分泌期 3.推遲菌體自溶期 4.維持抗生素較高的增長幅度。b補料內容1. 補充C源和能源物質如：液化淀粉、糊精、飴糖（麥芽糖）、G2. 補充N源物質如：酵母粉、蛋白胨、玉米漿、尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉、硝酸鉀、氨水3. 補充無機鹽、微量元素、前體和促

25、進劑如：磷酸鹽、硫酸鋅、硫酸錳、氯化鈷、氯化鈣、硫酸鈉、促進劑4. 補全料和補水c補料的控制補糖的控制0- 補糖時機的控制補糖時間對抗生素的產(chǎn)量有很大影響，過早補糖，刺激菌體生長，加速糖的利用，過遲補糖，菌體已經(jīng)受到部分損害，補糖只能干擾代謝，不能提高產(chǎn)量。舉例：四環(huán)素發(fā)酵補G62h 后補糖 產(chǎn)量 6000單位/毫升20h 6000 單位/毫升45h10000單位/毫升1- 補糖方式和補糖指標以還原糖作為指標，如四環(huán)素發(fā)酵還原糖0.8-1.5%以總糖作為指標，如土霉素發(fā)酵前期5-6%，中期4-5%，后期3-4%，放罐1-2%補糖方式：小量間隙多次補入、小量連續(xù)滴加補入、大量多次補入、大量少次補

26、入。5. 通氨及補氮作用：調節(jié)PH和補充無機氮源，從而控制產(chǎn)生菌的代謝活動方法：少量間隙添加或少量自動流加氨水：工業(yè)用20%氨水（快速）尿素（慢速）6. 補充無機元素和促進劑、前體（五）發(fā)酵過程中泡沫的產(chǎn)生和控制1、泡沫的產(chǎn)生及其對發(fā)酵的影響原因：1.機械攪拌2.培養(yǎng)基內本身含有發(fā)泡性物質危害：1.裝料系數(shù)減少2.泡沫頂罐增加染菌機會3.影響通氣攪拌，引起異常發(fā)酵2、泡沫的性質泡沫是氣體分散于液體中的一種膠體系統(tǒng)，氣泡間被一層液膜隔開彼此不相聯(lián)通。分散相是無菌空氣和代謝氣體，連續(xù)向是發(fā)酵液。泡沫類型：1.存在于發(fā)酵液的液面上，界面明顯、容易破滅2.界面不明顯、泡沫較穩(wěn)定，不易破碎3、影響泡沫消

27、長的因素a.與通氣攪拌的距離程度有關前期接種后加大空氣流量和全開攪拌，泡沫產(chǎn)量增加，甚至無法控制，前期空氣流量不需要太大，應先開小流量，逐步加大，待菌絲達到一定程度在加大流量，然后開攪拌并加消沫劑。b.與培養(yǎng)基的配比及原材料組成有關天然原料濃度大的培養(yǎng)基，黏度大，產(chǎn)泡多而持久。如葡萄糖、黃豆餅粉、蛋白胨、玉米漿、花生餅粉、酵母粉合成培養(yǎng)基不易產(chǎn)生泡沫。c.與菌種、種子質量、菌絲階段、接種量有關生長速度越快，泡沫越少。原因是菌絲大量繁殖，含氮物大量消耗利用，甚至可以提高罐溫，促進菌絲生長繁殖、以便減少泡沫的干擾。4、泡沫的消除a.機械消沫機械消沫主要靠機械引起的強烈振動或壓力變化促使氣泡破裂。罐

28、內消沫，攪拌軸上方裝消沫槳，效率不高罐外消沫，將泡沫引出罐外，通過噴嘴的加速作用或利用離心力消除泡沫優(yōu)點：不加入外界物料，節(jié)省原料，減少染菌的機會。缺點：效果差、需要一定設備、消耗動力，不能從根本上消除因其泡沫穩(wěn)定的因素。b.消沫劑消沫（化學消沫）加入某些活性物質，降低泡沫的局部表面張力使泡沫破裂的方法。機理：1.當泡沫表層存在著表面活性物質而形成雙電層時可以加入一種有相反電荷的表面活性劑，降低他的機械強度。2.具有較大的表面黏度時，可加入某些分子內聚力較小的物質，以降低液膜的表面黏度。優(yōu)點：消沫效果好、作用迅速缺點：有的具有毒性，殘留在發(fā)酵液中增加提煉的麻煩，有的影響溶解氧的傳遞，影響通氣攪

29、拌的效果，成本增加。（1） 天然油脂類玉米油、米糠油、魚油、蛹油，豆油、棉籽油、菜籽油、豬油天然油脂消沫效率不高，用量很大。（2） 化學合成類消沫劑a.泡敵：聚氧丙烯甘油（GP型）聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE型）用量：0.02-0.035% 性能穩(wěn)定、能耐受高溫高壓滅菌、操作簡便、用量少、成本低，易掌握。b.十八醇：青霉素發(fā)酵使用c.聚乙二醇：適用于霉菌發(fā)酵d硅酮類：對微酸性抗生素發(fā)酵效果差，適用于堿性抗生素如鏈霉素、新霉素。任務三 青霉素發(fā)酵工藝及過程（一）、菌種 黃孢子絲狀菌 絲狀菌 綠孢子絲狀菌產(chǎn)黃青霉菌球狀菌 綠孢子球狀菌 白孢子球狀菌（三）、發(fā)酵工藝過程及要點1、種子絲狀菌的生產(chǎn)菌種保

30、藏在砂土管中。由砂土孢子接入拉氏培養(yǎng)基的目瓶斜面上，經(jīng)25OC培養(yǎng)6-7天，長成綠色孢子，只成孢子懸浮液，接入裝有大米的茄子瓶中，經(jīng)25OC，相對濕度50-45%，培養(yǎng)6-7天，制成大米孢子，真空干燥。生產(chǎn)時按一定接種量移入種子罐內，25OC培養(yǎng)40-45小時，菌絲濃度達40%以上，菌絲形態(tài)正常，即按10-15%的接種量移入繁殖罐內。經(jīng)25OC培養(yǎng)13-15小時，菌絲體積40%以上，殘?zhí)?.0%.發(fā)酵罐接種量為30%球狀菌的生產(chǎn)種子由冷凍管孢子經(jīng)0.5-1.0%的玉米漿的原始親米孢子，移入羅氏瓶25OC培養(yǎng)3-4天生產(chǎn)大米孢子（生產(chǎn)米）。將生產(chǎn)米接入含花生餅粉、玉米胚牙粉、G、飴糖為主的種子罐

31、內，28OC培養(yǎng)50-60小時，當PH由6.5-6.0下降至5.5-5.0，菌絲呈菊花團狀，每毫升球數(shù)為6-8只2 發(fā)酵培養(yǎng)基a.碳源主要碳源為葡萄糖母液和工業(yè)用葡萄糖b.氮源玉米漿、花生餅粉、麩質粉、玉米胚牙粉、尿素c前體苯乙酸、苯乙酰胺作為前體，具有毒性，任何時候濃度不能大于0.1%d無機鹽0- S和P 青霉素的液泡中含有S和P，青霉素的生物合成也需要硫。據(jù)報道，硫濃度降低時青霉素的產(chǎn)量減少三倍，磷濃度降低時青霉素的產(chǎn)量減少一倍。1- Ca Mg K 陽離子總濃度以300毫克當量/升鉀 30% 鈣 20% 鎂41%鐵離子 鐵離子對細胞具有毒害作用3.培養(yǎng)條件控制 菌絲生長繁殖期：糖及含氮物

32、質被迅速利用球狀菌：菌絲發(fā)育為球狀，菌體濃度迅速增加絲狀菌：菌絲分支旺盛，菌絲濃度迅速增加 青霉素分泌期：菌絲生長趨勢減弱，需添加G、花生餅粉、尿素。青霉素分泌旺盛 球：PH6.6-6.9 球體不可太松，也不可太緊 絲：PH6.2-6.4 脂肪粒消失，中小型空胞 菌絲自溶期：菌體衰老走向自溶PH上升青霉素分泌下跌 球：球體破裂 絲：大型空胞增加并逐漸擴大自溶a.加糖控制絲：殘?zhí)强刂圃?.6%左右，PH上升以后開始加糖。 加糖控制：0-72小時 0.6-0.8% 72小時放罐0.8-1.0% 加糖率每小時0.07-0.15% 每兩小時加一次球：當Ph高于6.5，約20之后開始加糖，根據(jù)PH高低酌情。b.補料及添加前體絲：接種后8-12小時，發(fā)酵液濃度40%左右開始補料 發(fā)酵單位上升至2500U/ml開始補前體，每4小時補一次 使苯乙酰胺濃度為0.05-0.08%球：因發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中沒有前體，在10小時左右開始加入 尿素、氨水和苯醋酸的混合料，每3小時加一次c.PH控制主要通過加G控制PH絲: PH6.2-6.4球：PH6.7-7.0d.溫度控制青霉