1、對(duì)基因進(jìn)行操作的對(duì)基因進(jìn)行操作的“手術(shù)刀手術(shù)刀”、 “縫縫合針合針”、 “運(yùn)輸工具運(yùn)輸工具” 分別是什么物分別是什么物質(zhì)？有何作用？質(zhì)？有何作用？第1頁/共52頁 基因工程的剪切、拼接、導(dǎo)入、表達(dá)基因工程的剪切、拼接、導(dǎo)入、表達(dá)的具體過程是怎么樣的呢？的具體過程是怎么樣的呢？第2頁/共52頁第3頁/共52頁基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4 4、目的基因的檢測(cè)與鑒定、目的基因的檢測(cè)與鑒定剪切：剪切：拼接：拼接：導(dǎo)入：導(dǎo)入：表達(dá)：表達(dá)：第4頁/共52頁什么是目的基因？什

2、么是目的基因？第5頁/共52頁目的基因的來源？目的基因的來源？1 1、從自然界中已有的物種中分離、從自然界中已有的物種中分離2 2、人工方法合成、人工方法合成第6頁/共52頁第7頁/共52頁什么是基因文庫？什么是基因文庫？ 將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因?yàn)槭裁匆獦?gòu)建基因文庫？為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？第8頁/共52頁第9頁/共52頁基因文庫種類基因文庫種類基因組文庫：基因組文庫： 含有某種生物的全部基因含有某種生物的全部基因部分基因文庫（如部分基因

3、文庫（如cDNAcDNA文庫）文庫）： 含有某種生物的一部分基因含有某種生物的一部分基因如何構(gòu)建基因組文庫和部分基因文庫呢？如何構(gòu)建基因組文庫和部分基因文庫呢？第10頁/共52頁提取某種生物的提取某種生物的全部全部DNADNA限制酶切割限制酶切割一定大小的一定大小的DNADNA片段片段與載體連接與載體連接導(dǎo)入受體菌中導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存儲(chǔ)存基因組文庫基因組文庫第11頁/共52頁某種生物的單鏈某種生物的單鏈mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶互補(bǔ)的單鏈互補(bǔ)的單鏈DNADNADNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈CDNACDNA片段片段與載體連接與載體連接導(dǎo)入受體菌種導(dǎo)入受體菌種儲(chǔ)存儲(chǔ)存CDNACDNA文庫文庫

4、第12頁/共52頁如何從基因文庫中獲取所需要的基因？如何從基因文庫中獲取所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色體上的位置基因的功能基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì) 等特性。第13頁/共52頁利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因一段一段已知已知的目的基因序列的目的基因序列第14頁/共52頁 通過通過2 2n n形式擴(kuò)增獲取大量的目的基因形式擴(kuò)增獲取大量的目的基因 DNADNA復(fù)制（體外）復(fù)制（體外） 堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則 4 4種脫氧

5、核苷酸種脫氧核苷酸 PCRPCR儀儀 TaqTaq酶（耐熱的酶（耐熱的DNADNA聚合酶）、引物等聚合酶）、引物等目的：目的：原理：原理： 原則：原則：原料：原料： 場(chǎng)所：場(chǎng)所： 條件：條件： 第15頁/共52頁過程：過程：a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂斷裂，形成，形成_b b、退火（、退火（復(fù)性55-6055-60）：系統(tǒng)溫度降低，）：系統(tǒng)溫度降低，引引 物與物與DNADNA模板結(jié)合模板結(jié)合，形成局部，形成局部_。 c c、延伸（延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，從的作用下，

6、從 引物的引物的55端端33端延伸，合成與模板互補(bǔ)端延伸，合成與模板互補(bǔ) 的的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈第16頁/共52頁質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理一個(gè)切口一個(gè)切口形成兩個(gè)黏性末端形成兩個(gè)黏性末端或平末端或平末端兩個(gè)切口兩個(gè)切口獲得含有相同黏性末獲得含有相同黏性末端的目的基因端的目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種二二. .基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建( (一一) )過程過程: :第17頁/共52頁 科學(xué)家在培育抗蟲棉時(shí)，經(jīng)歷了多次失敗，才科學(xué)家在培育抗蟲棉時(shí)，經(jīng)歷了多次失

7、敗，才獲得成功。獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達(dá)。棉花體內(nèi)沒有表達(dá)。 然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子啟動(dòng)子( (抗抗蟲基因首端蟲基因首端) )，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲基還是沒有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入因的質(zhì)粒中插入終止子終止子( (抗蟲基因末端抗蟲基因末端) )，導(dǎo)入棉花，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)

8、果成長的植株，有了抗蟲能力。受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。 作為基因表達(dá)載體，只需含有目的基因就可作為基因表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？以完成任務(wù)嗎？為什么？ 第18頁/共52頁目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。a a、目的基因、目的基因b b、啟動(dòng)子、啟動(dòng)子c c、終止子、終止子d d、標(biāo)記基因、標(biāo)記基因第19頁/共52頁閱讀與思考：閱讀與思考：啟動(dòng)子、終止子有何作用？啟動(dòng)子、終止子有何作用？標(biāo)記基因有什么作用

9、？標(biāo)記基因有什么作用？第20頁/共52頁啟動(dòng)子：啟動(dòng)子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，它是片斷，它是RNARNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質(zhì)，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：終止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，片斷，能終能終止止mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因標(biāo)記基因的作用是的作用是為了為了鑒別鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來胞篩選出來第21頁

10、/共52頁啟動(dòng)子與起始密碼子？終止子與終止密碼子？ 啟動(dòng)子和終止子：啟動(dòng)子和終止子：DNADNA上上啟動(dòng)子：驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子：驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄終止子：終止轉(zhuǎn)錄終止子：終止轉(zhuǎn)錄 起始密碼子和終止密碼子：起始密碼子和終止密碼子：mRNAmRNA上上起始密碼子：驅(qū)動(dòng)翻譯起始密碼子：驅(qū)動(dòng)翻譯終止密碼子：終止翻譯終止密碼子：終止翻譯第22頁/共52頁閱讀與思考：閱讀與思考：基因的運(yùn)載體、目的基因、啟動(dòng)子、終止子基因的運(yùn)載體、目的基因、啟動(dòng)子、終止子等都是等都是DNA片斷，如何將它們連接起來？片斷，如何將它們連接起來？第23頁/共52頁載體載體與與表達(dá)載體表達(dá)載體的區(qū)別？的區(qū)別？二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分二者

11、都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNADNA片段。片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)用到的工具酶？用到的工具酶？既用到限制酶切割載體，又用到既用到限制酶切割載體，又用到DNADNA連接酶將連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵是磷酸二酯鍵第24頁/共52頁三將目的基因?qū)肴龑⒛康幕驅(qū)胧荏w受體細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化目的基因進(jìn)入目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持受體細(xì)胞內(nèi)維持_和和_的過程的過程受體細(xì)胞受體細(xì)胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)第25頁/

12、共52頁1 1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。第26頁/共52頁目的基因目的基因TiTi質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNAT-DNA重組重組構(gòu)建表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌導(dǎo)入導(dǎo)入植物細(xì)胞植物細(xì)胞a a、d d指的是什么過程？指的是什么過程？農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖第27頁/共52頁（2）基因槍法 基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載

13、體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。第28頁/共52頁（3）花粉管通道法 植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。第29頁/共52頁2 2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法方法：顯微注射法程序：程序：(目的基因)表達(dá)載體 取卵（受精卵） 顯微注射 新性狀動(dòng)物第30頁/共52頁3 3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞

14、、遺傳物質(zhì)少方法：方法： 用Ca2+處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子第31頁/共52頁思考與探究：思考與探究： 利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識(shí)，結(jié)合基因工程操作前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識(shí)，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？白，可以用大腸桿菌嗎？ 有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的

15、，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。 第32頁/共52頁深度思考：深度思考：如何篩選出被重組質(zhì)粒侵入的受體細(xì)胞。如何篩選出被重組質(zhì)粒侵入的受體細(xì)胞。第33頁/共52頁青霉素培養(yǎng)基青霉素抗性基因第34頁/共52頁思考：思考： 2、目的基因是否穩(wěn)定的存在于轉(zhuǎn)基因生物、目的基因是否穩(wěn)定的存在于轉(zhuǎn)基因生物并按人們的預(yù)期進(jìn)行表達(dá)，需要在那些水平上并按人們的預(yù)期進(jìn)行表達(dá)，需要在那些水平上進(jìn)行檢測(cè)？進(jìn)行檢測(cè)？第35頁/共52

16、頁四：目的基因的檢測(cè)與表達(dá)四：目的基因的檢測(cè)與表達(dá)分子分子水平水平檢測(cè)檢測(cè)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法方法方法方法方法方法DNADNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)抗原抗原- -抗體雜交技術(shù)抗體雜交技術(shù)第36頁/共52頁1、提取受體生物、提取受體生物DNA，并解旋成單鏈；，并解旋成單鏈；2、用標(biāo)記了放射性同位素的目的、用標(biāo)記了放射性同位素的目的DNA片段單鏈作片段單鏈作為探針；為探針

17、；3、檢測(cè)兩者是否進(jìn)行雜交；、檢測(cè)兩者是否進(jìn)行雜交；第37頁/共52頁第38頁/共52頁分子分子水平水平檢測(cè)檢測(cè)個(gè)體個(gè)體水平水平鑒定鑒定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子雜交分子雜交mRNA-DNA mRNA-DNA 分子雜交分子雜交抗原抗原- -抗體雜交抗體雜交第39頁/共52頁例：用棉鈴飼喂棉例：用棉鈴飼喂棉

18、鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)?？瓜x基因并得到表達(dá)。第40頁/共52頁-珠蛋白是動(dòng)物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的珠蛋白是動(dòng)物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時(shí)，動(dòng)物有可能患某種疾病，如鐮刀形成分異常時(shí)，動(dòng)物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的腸桿菌生產(chǎn)出鼠的-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)

19、計(jì)？設(shè)計(jì)？ 嘗試設(shè)計(jì)嘗試設(shè)計(jì) 第41頁/共52頁1）獲取小鼠）獲取小鼠-珠蛋白基因的編碼序列（珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。）。2）將）將cDNA、在大腸桿菌中可以適用的啟動(dòng)子、在大腸桿菌中可以適用的啟動(dòng)子、終止子、抗四環(huán)素的基因、質(zhì)粒等，構(gòu)建成一個(gè)終止子、抗四環(huán)素的基因、質(zhì)粒等，構(gòu)建成一個(gè)表達(dá)載體。表達(dá)載體。3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，）將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿菌中，大腸桿菌會(huì)因不果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿菌中，大腸桿菌會(huì)因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培

20、養(yǎng)基上長出大含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明腸桿菌菌落，則表明-珠蛋白基因已進(jìn)入其中。珠蛋白基因已進(jìn)入其中。4）培養(yǎng)進(jìn)入了）培養(yǎng)進(jìn)入了-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后檢測(cè)體，破碎后檢測(cè)-珠蛋白含量，若符合要求，則可珠蛋白含量，若符合要求，則可用于生產(chǎn)。用于生產(chǎn)。第42頁/共52頁歸納歸納: 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.1.獲取目的基因u從基因文庫u利用PCRPCRu化學(xué)方法人工合成2.2.構(gòu)建基因表達(dá)載體u目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因3.3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞u農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法4.4.目的基因的檢測(cè)與鑒定u檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯u鑒定：第43頁/共52頁什么是目的基因？什么是目的基因？第44頁/共52頁目的基因的來源？目的基因的來源？1 1、從自然界中已有的物種中分離、從自然界中已有的物種中分離2 2