1、會(huì)計(jì)學(xué)1免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)第一頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。一. 概述(一) 發(fā)展歷史u 1971年 Faulk和Taylon 用兔抗沙門氏菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合, 制備成金標(biāo)抗體, 檢測(cè)細(xì)菌表面抗原的分布u 1975年 Horisberger等 把膠體金技術(shù)推廣應(yīng)用于掃描電鏡、透射電鏡及冰凍蝕刻電鏡的研究u 1978年 Geoghegan 發(fā)表了膠體金標(biāo)記物在光鏡水平的應(yīng)用u 1981年 Danscher 建立了銀顯影液增強(qiáng)，光鏡第1頁(yè)/共33頁(yè)第二頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。 下金顆?？梢娦缘姆椒╱ 1983年 Moeremans等 在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移電泳中應(yīng)用了免疫金

2、銀染色法 u 1986年 Fritz等 在免疫金銀法基礎(chǔ)上成功進(jìn)行了彩色免疫金銀染色 第2頁(yè)/共33頁(yè)第三頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。 免疫膠體金技術(shù)以膠體金為標(biāo)記物應(yīng)用在免疫組織化學(xué)研究中，對(duì)細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的多糖、糖蛋白、蛋白質(zhì)、多肽、激素和核酸等生物大分子進(jìn)行定位研究第3頁(yè)/共33頁(yè)第四頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。（二）膠體金的基本概念膠體金，一般指金的水溶液，又稱金溶膠。-金以微小的粒子分散在水中所形成的金 溶膠。其中分散的金顆粒直徑在1100nm 之間。第4頁(yè)/共33頁(yè)第五頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。 二. 膠體金的制備(一) 可用多種方法制備膠體金分散法:包

3、括機(jī)械分散法、超聲波法、電分散法和膠溶法等 凝聚法:包括物理凝聚法、化學(xué)凝聚法（氧化法、水解法和還原法）1. 其中應(yīng)用最多的是化學(xué)還原法第5頁(yè)/共33頁(yè)第六頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。 化學(xué)還原法【基本原理】在氯化金水溶液中加入一定量的還原劑，使金離子還原為金原子。在適當(dāng)條件下，還原的金原子凝聚成一定大小的金顆粒，形成金溶膠。【常用還原劑】檸檬酸鈉、鞣酸、白磷等檸檬酸鈉還原制備的金顆粒直徑較大，15150nm白磷還原制備的金顆粒直徑較小，312nm【具體制備方法】第6頁(yè)/共33頁(yè)第七頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。（二）影響溶膠穩(wěn)定性的因素u 電解質(zhì)u 膠體金濃度u 溫度u 大分子

4、物質(zhì) 第7頁(yè)/共33頁(yè)第八頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。（三）膠體金的鑒定【鑒定方法】在電鏡下觀察金顆粒的大小及金顆粒的均勻程度【鑒定方法】將膠體金滴在覆有Formvar膜或碳- Formvar膜的鎳網(wǎng)上，空氣干燥，透射電鏡下觀察，拍照，測(cè)量金顆粒的直徑，并計(jì)算100個(gè)以上膠體金顆粒直徑的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差第8頁(yè)/共33頁(yè)第九頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。（四）制備膠體金的注意事項(xiàng)1. 玻璃器皿的清潔2. 試劑配制3. 影響膠體金顆粒大小的因素 玻璃器皿清洗清潔液浸泡24h 流水沖蒸餾水反復(fù)洗滌晾干應(yīng)盡量使用分析純?cè)噭└鞣N水溶液必須用三蒸水或去離子水配制加入還原劑的速度攪拌是否均勻制備

5、膠體金所用的燒瓶大小第9頁(yè)/共33頁(yè)第十頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。三. 膠體金探針的制備(一) 膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合的原理膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的過程, 實(shí)際上是蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)或稍偏堿時(shí), 被吸附于膠體金顆粒表面.第10頁(yè)/共33頁(yè)第十一頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。（二）膠體金的預(yù)處理 標(biāo)記之前將膠體金的PH值調(diào)至待標(biāo)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或略偏堿調(diào)節(jié)PH的方法： 當(dāng)需要提高膠體金的PH值時(shí)，用0.2mol/L K2CO3或0.1mol/L KOH 當(dāng)需要降低膠體金的PH值時(shí), 用0.1M HCL或醋酸 第11頁(yè)/共33頁(yè)第十二頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。(三) 待標(biāo)記蛋白質(zhì)的處理1

6、. 透析除鹽: 將蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中, 放 在蒸餾水中透析, 4過夜2. 離心: 10000 r/min, 4, 1h, 去除蛋白質(zhì)聚 合物等沉淀第12頁(yè)/共33頁(yè)第十三頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。(四) 膠體金蛋白質(zhì)最佳結(jié)合率測(cè)定 不同直徑的金顆粒, 及不同分子量大小的蛋白質(zhì), 其結(jié)合的比例是不同的常用的檢測(cè)二者結(jié)合量的方法有目測(cè)法和光電比色法第13頁(yè)/共33頁(yè)第十四頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。1. 目測(cè)法 先將待標(biāo)記蛋白質(zhì)逐級(jí)稀釋 取一批小試管，編號(hào)，每管內(nèi)加已調(diào)好PH的膠體金100ul 按從低高的濃度，將已稀釋好的蛋白溶液，分別加入已編號(hào)的試管中，對(duì)照管只加不含蛋白的

7、稀釋液，混勻，靜置5 10 min 各管分別加10%NaCl 10l，混勻，靜置2hr，觀察結(jié)果第14頁(yè)/共33頁(yè)第十五頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。123 4576膠體金(ml) 1 1 1 1 1 1 1蛋白質(zhì)(ug) 5 10 15 20 25 30 3510%NaCl 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 結(jié)果判斷: 對(duì)照管或加入蛋白量不足，膠體金出現(xiàn)由紅變藍(lán)的凝聚現(xiàn)象；加入蛋白質(zhì)量達(dá)到或超過穩(wěn)定量，則膠體金保持紅色不變第15頁(yè)/共33頁(yè)第十六頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。2. 光電比色法利用分光光度計(jì)測(cè)各管580nm的OD值, 然后以O(shè)D值為縱坐標(biāo), 蛋

8、白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)作一曲線, 取曲線最先與橫軸相接近的那一點(diǎn)的蛋白質(zhì)濃度, 即為最適穩(wěn)定量.第16頁(yè)/共33頁(yè)第十七頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。(五）標(biāo)記1. 計(jì)算所需待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量 根據(jù)用以標(biāo)記的膠體金溶液總體積及所測(cè)定的最適蛋白質(zhì)穩(wěn)定量，計(jì)算出所需待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量2. 調(diào)節(jié)PH：根據(jù)所標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)來調(diào)節(jié)膠體金的 PH第17頁(yè)/共33頁(yè)第十八頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。常用幾種蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金的 PH蛋白質(zhì) PH 抗體 9.0 SPA 6.0過氧化物酶 8.0低密度脂蛋白 5.5第18頁(yè)/共33頁(yè)第十九頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。3. 磁力攪拌下，逐滴加入

9、蛋白質(zhì)溶液，作用 515min4. 繼續(xù)磁力攪拌，加入5牛血清白蛋白，使其終濃度為1，攪拌10min；也可加3聚乙二醇，使其終濃度為0.05第19頁(yè)/共33頁(yè)第二十頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。（六）標(biāo)記探針的純化u 純化的目的 去除溶液中未標(biāo)記的 蛋白質(zhì)，未充分穩(wěn)定的膠體金，以及在標(biāo)記過程中可能產(chǎn)生的各種聚合物u 純化的方法 超速離心法和凝膠過濾法第20頁(yè)/共33頁(yè)第二十一頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。 1. 超速離心法速度快，適合大樣品的制備 離心 1500 r min，20min 棄沉淀 超速離心 4 1h 棄上清 沉淀用PBS或TBS緩沖液（含0.1牛血清白蛋白重新懸浮至原

10、體積的 1 101 20 離心 1500 r min，20min 棄沉淀 分裝 4 保存第21頁(yè)/共33頁(yè)第二十二頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。2. 凝膠過濾法u 將探針溶液裝入透析袋內(nèi)， 4 ，置于硅膠或聚乙二醇中濃縮至原體積的1 41 5u 離心 1500 r min，20min 棄沉淀u 經(jīng)Sephacryl（丙烯葡聚糖）S400層析柱分離純化。用0.02mol/L TBS(0.1%BSA)洗脫 TBS的PH根據(jù)蛋白質(zhì)種類而定u 按紅色深淺分管收集洗脫液 第22頁(yè)/共33頁(yè)第二十三頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。(七) 標(biāo)記探針的鑒定1. 負(fù)染色檢查: 將膠體金溶液滴在覆有Fo

11、rmavar膜(支持膜) 的鎳網(wǎng)上, 空氣中干燥, 醋酸鈾負(fù)染, 透射電鏡下觀察2. 生物活性鑒定: 可用直接或間接法放射免疫測(cè)定, 凝聚試驗(yàn)及免疫組化染色進(jìn)行鑒定第23頁(yè)/共33頁(yè)第二十四頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。四. 免疫膠體金染色方法第24頁(yè)/共33頁(yè)第二十五頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。 (一)免疫金染色法 Immunogold staining, IGS【基本原理】 1. 直接法-將膠體金標(biāo)記的一抗直接對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染色,然后在光鏡或電鏡下觀察 方法簡(jiǎn)單, 但一種探針僅限于檢測(cè)一種抗原, 較局限 2. 間接法-先將未標(biāo)記的特異性一抗與標(biāo)本中的抗原結(jié)合, 然后加金標(biāo)二抗或S

12、PA與一抗結(jié)合, 在光鏡或電鏡下對(duì)抗原的分布進(jìn)行定位研究第25頁(yè)/共33頁(yè)第二十六頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。第26頁(yè)/共33頁(yè)第二十七頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分?！咎攸c(diǎn)】 1. 陽(yáng)性部位顯紅色 2. 染色程序簡(jiǎn)便, 不需顯色或顯影過程 3. 但一般要求金顆粒的直徑20nm, 并要求用 高濃度的免疫金溶液第27頁(yè)/共33頁(yè)第二十八頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。 (二) 免疫金銀染色法Immunogold silver staining, IGSS1983年 Holgate及其同事在IGS的基礎(chǔ)上與銀顯影方法相結(jié)合, 建立了免疫金銀法【基本原理】經(jīng)免疫反應(yīng)沉積在抗原位點(diǎn)處的

13、膠體金顆粒作為一種催化劑，在對(duì)苯二酚存在的情況下，將顯影液中的銀離子催化還原成銀原子，可將抗原位點(diǎn)清楚顯示出來第28頁(yè)/共33頁(yè)第二十九頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。1. 光鏡免疫金銀法3 在免疫金染色的基礎(chǔ)上增加物理顯影的步驟3 顯影液的配制及顯影過程應(yīng)在暗處進(jìn)行3 陽(yáng)性部位呈黑色顆粒狀2. 電鏡免疫金銀法 包埋前染色, 包埋后染色第29頁(yè)/共33頁(yè)第三十頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分?！綢GSS法優(yōu)點(diǎn)】 1. 可被用于光鏡和電鏡觀察 2. 敏感性高 3. 定位準(zhǔn)確 4. 背景清晰, 對(duì)比度好 5. 方法簡(jiǎn)便, 安全 6. 成本較低, 標(biāo)本可長(zhǎng)期保存第30頁(yè)/共33頁(yè)第三十一頁(yè)，編輯于星期一：十四點(diǎn) 四十九分。 (三) 彩色免疫金銀染色法 Coloured IGSS, CIGSS【基本原理】 組織切片經(jīng)IGSS染色后, 抗原抗體反應(yīng)部位生成的銀顆粒通過鐵氰化鉀和溴化鉀的作用, 使銀原子被氧化生成金屬銀