1、 HLA-B27檢測方法 本公司本公司試劑試劑盒盒簡簡介介第1頁/共47頁第一頁，共48頁。 1.HLA-B27抗原(kngyun)分子及其等位基因第2頁/共47頁第二頁，共48頁。 HLA-B27抗原分子結構(fn z ji u)及其特點 HLA-B27抗原分子是由位于人類第六號染色 體短臂上B*27等位基因編碼的糖蛋白, 分子量 為56103U。 由兩條多肽鏈組成，一條為鏈或重鏈，分子 量約為44103U，包括胞外區(qū)，跨膜區(qū)，胞 內區(qū)三個結構域，其中胞外區(qū)又分為1，2， 3三個結構區(qū)；另一條為鏈或輕鏈即2微 球蛋白，分子量約12103U，二者結合(jih)共同 組成HLA-B27抗原分子。

2、第3頁/共47頁第三頁，共48頁。HLA-B27HLA-B27抗原抗原(kngyun)(kngyun)分子結構分子結構第4頁/共47頁第四頁，共48頁。 1區(qū)與2區(qū)的肽鏈折疊后共同構成一個抗原 結合凹槽，槽內形成A,B,C,D,E,F共6個袋狀結 構，其中(qzhng)B袋在HLA-B27分子中是最保守的結構。 凹槽的作用是結合抗原肽，使抗原肽與HLA-B27 分子牢固的結合。第5頁/共47頁第五頁，共48頁。HLA-BHLA-B* *2727等位基因結構等位基因結構(jigu)(jigu)及其特點及其特點2002年WHO正式命名的HLAB*27 等位基因達到了24個，其中只有15個 有相對應

3、的抗原表達。到2009年11月 WHO正式命名HLAB*27等位基因 達到59個(B*2701一B*2759) 。 HLAB*27等位基因呈多態(tài)性，主要(zhyo) 是因為個別的堿基突變造成的，編碼蛋 白的差異主要(zhyo)集中在l、2結構區(qū)內。第6頁/共47頁第六頁，共48頁。 其中HLA-B*2701與HLA-B*2705編碼的蛋白 在78-81范圍內有2個氨基酸的不同(b tn)； 其中HLA-B*2702與HLA-B*2705編碼的蛋白 在78-81范圍內有3個氨基酸的不同(b tn)； 其中HLA-B*2703與HLA-B*2705編碼的蛋白 僅有1個氨基酸的差別，即在59位前者

4、為組氨酸（His），后者為酪氨酸（Tyr）；第7頁/共47頁第七頁，共48頁。 HLA-B*2705基因分布最廣，幾乎見于所有人種。 甚至認為其它等位基因都是由HLA-B*2705基因發(fā) 生突變、移位形成的。 HLA-B*2705編碼的蛋白(dnbi)最為顯著的特點就是在B袋 上的45位發(fā)生氨基酸的突變，這一改變直接影響 HLA-B27分子在細胞表面的表達，影響HLA-B27分 子與抗原肽的結合，同時影響了HLA-B27分子對胞 內外抗原的遞呈。第8頁/共47頁第八頁，共48頁。 2.與HLA-B27相關(xinggun)的疾病第9頁/共47頁第九頁，共48頁。 強直性脊柱炎 （ankylos

5、ing spondylitis AS） 幼年(yunin)類風濕關節(jié)炎 （juvenile rheumatoid arthritis JRA) 急性前葡萄膜炎 (acute anterior uveitis，AAU) 白血病等疾病第10頁/共47頁第十頁，共48頁。強直性脊柱炎（強直性脊柱炎（ASAS） 1973年Brewerton和schiosstein發(fā)現 強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis AS）與HLA-B27抗原有 非常強的相關,這是目前唯一有臨床 價值的血型(xuxng)相關抗原,這在迄今已知 的HLA與疾病的關聯(lián)中是最強和最典 型的。第11頁/共47頁第十

6、一頁，共48頁。AS的抗原(kngyun)學檢測 【HLA-B27與強直性脊柱炎的臨床分析】報道：HLA-B27抗原陽性率在AS患者高達96以上，而正常(zhngchng)群體中僅4%-7%,HLA-B27抗原攜帶者發(fā)生AS的相對危險率高達70%。第12頁/共47頁第十二頁，共48頁。與AS相關(xinggun)的B*27等位基因第13頁/共47頁第十三頁，共48頁。AS的基因學檢測(jin c) 不同(b tn)人群的AS患者涉及的B*27等位基因第14頁/共47頁第十四頁，共48頁。 與AS相關(xinggun)的B*27等位基因第15頁/共47頁第十五頁，共48頁。不同人群不同人群AS患

7、者患者(hunzh)中中HLA-B*27等位基因頻率等位基因頻率不同人群不同人群AS患者患者(hunzh)的的HLA-B*27等位基因頻率等位基因頻率摘自【摘自【HLAB*27高分辨等位基因在高分辨等位基因在1 606例疑似強直性脊柱炎患者例疑似強直性脊柱炎患者(hunzh)中的表中的表達】達】第16頁/共47頁第十六頁，共48頁。HLA-B27與AS致病機制(jzh)的研究 HLA-B27分子與非折疊(zhdi)蛋白理論假說 HLA-B27分子游離重鏈與AS 其它第17頁/共47頁第十七頁，共48頁。HLA-B27分子非折疊(zhdi)蛋白理論假說 HLA I類分子是在內質網成熟的，新合成(

8、hchng)的HLA I進入內質網腔 與鈣連蛋白結合，使I類分子在內質網中維持部分折疊，繼而與新 合成(hchng)的2-微球蛋白組裝成完整的I類分子，此時B27分子才能被認 為是成熟的，轉運至細胞表面。研究發(fā)現，HLA-B27折疊速度較其他 HLA分子（非HLA-B27分子）慢。導致內質網腔中出現大量的折疊不 良或部分折疊的HLA-B27重鏈部分，通常情況下，非折疊的重鏈在內 質網腔內能夠被清除，但由于一些相關物質的缺乏或無效，所致非折 疊的重鏈堆積，形成了非折疊蛋白反應。有資料報道，AS的發(fā)生可能 與這些HLA-B27分子的未折疊有關。第18頁/共47頁第十八頁，共48頁。HLA-B27分

9、子(fnz)游離重鏈與AS HLA-B27分子的主要功能是：識別和處理抗原肽，然后在遞呈給T淋巴細胞。HLA-B27分子具有特殊的生物學效應，它在體外具有形成重鏈二聚體的能力，主要是通過B27分子第67位氨基酸的殘基半氨酸的二硫鍵結合形成穩(wěn)定的二聚體。通過認識HLA-B27分子結構的特異性，重要的是深入研究游離重鏈的表達是否應該認為是導致AS的發(fā)病原因之一。當HLA-B27分子適當的、正確的組裝時，其遞呈的抗原肽通常被CD8 CTL識別；但當AS發(fā)生時，限制性的CIM Th細胞卻能識別非折疊、空載或缺失的B27分子。在這種情況下，就是HLA II類分子遞呈B27重鏈，降解后形成的多肽被CD4

10、Th細胞識別后導致關節(jié)炎癥。此研究目前還存在(cnzi)爭議。第19頁/共47頁第十九頁，共48頁。其它(qt) HLA-B27可提高致關節(jié)炎的細菌在胞內的存活率， 從而加劇關節(jié)炎的嚴重(ynzhng)度。 B27改變信號轉導學說，即HLA-B27通過修飾 炎癥因子基因相關的信號轉導過程而致關節(jié)炎。 HLA-B39,HLA-B60可能對AS的誘發(fā)起到一定的作用。第20頁/共47頁第二十頁，共48頁。幼年幼年(yunin)(yunin)類風濕性關節(jié)炎（類風濕性關節(jié)炎（JRAJRA） 幼年類風濕性關節(jié)炎（juvenile rheumatoid arthritis JRA)是類風濕性關節(jié)炎疾病中的一

11、個特殊類型，而HLA-B27抗原(kngyun)陽性的幼年類風濕關節(jié)炎又是類風濕關節(jié)炎疾病中的一個亞型。幼年類風濕性關節(jié)炎是兒童時期較常見的結締組織病，國外的報道發(fā)現，較多的幼年類風濕性關節(jié)炎患者的HLA-B27抗原(kngyun)呈現陽性，且沒有男女性別差異。第21頁/共47頁第二十一頁，共48頁。 【differential diagnosis juvenile ankylosing spondylitis and juvebile rheumatoid arthritis by subtypes of HLA-B27 alleles】報道：和該疾病相關 的HLA-B*27的等位基因涉及(

12、shj)B*2705,B*2704, B*2707,B*2702基因。在HLA-B27抗原陽性的 JRA患者中，B*2705基因占60.7%，B*2704基 因占28.57%，B*2702基因占3.57%，B*2707 基因占7.14%。第22頁/共47頁第二十二頁，共48頁。HLA-B27與JRA致病機制(jzh)的研究 以各種感染性微生物作為外來抗原（HLA-B27分子(fnz)與其結構有相似性），激活免疫細胞，通過損傷或分泌細胞因子觸發(fā)異常的免疫反應，引起自身組織的損害和變性。 特別是細菌、病毒的特殊成分作為超抗原，其結構與人類MHC抗原有同源性，不需抗原呈遞細胞加工處理，即可直接與T細

13、胞受體直接結合（HLA-B27充當細胞表面受體），激活T細胞。第23頁/共47頁第二十三頁，共48頁。急性急性(jxng)(jxng)前葡萄膜炎（前葡萄膜炎（AAU)AAU) 急性前葡萄膜炎(acute anterior uveitis，AAU)是一類常見(chn jin)的自身免疫性致盲眼病 ，病因復雜、病程長、易反復發(fā)作,要確定其發(fā)病原因仍比較困難。自1973年Brewerton DA等人首次報道HLAB27抗原與AAU之間的相關性以來，迄今為止，已發(fā)現2O多種眼病與HLA抗原具有相關性 ，其中最主要的是HLAB27抗原與AAU之間的相關性。第24頁/共47頁第二十四頁，共48頁。 【As

14、sociation between HLA-B27 antigen and acute anterior uveitis】指出(zh ch)：國內外報道有所不同，國內報道37.0-60 AAU患者HLA-B27抗原呈陽性，國外報道19-88呈陽性,而B*27等位基因與AAU的關系報道較少。 【acute anterior uveitis and HLA-B27】報道，在HLA-B27抗原陽性的AAU患者中,HLA-B*2704基因占447%, B*2705基因占56%。第25頁/共47頁第二十五頁，共48頁。HLA-B27與AAU致病機制( jzh)的研究 葡萄膜炎-受體假說：HLAB27(+

15、)的AAU可能 由于HLAB27分子擔當細胞表面(biomin)受體，其與微 生物結合，由此引起葡萄膜炎。 分子擬態(tài)假說:HLAB27分子在結構上與激發(fā) 引起AAU的微生物肽序列相似,從而引發(fā)葡萄膜炎。第26頁/共47頁第二十六頁，共48頁。其它(qt)疾病 【Genetic markers linked to rheumatoid arthritis are also strongly associated with articular manifestations in ulcerative colitis patients】 【Flt3一ITD mutations can generat

16、e leukaemia specific neoepitopes： potential role for immunotherapeutic approaches】 【Ankylosing spondylitis is linked to Klebsiellathe evidence】 等三篇文獻報道：HLA-B27抗原(kngyun)與白塞氏病也有一定的相關性。第27頁/共47頁第二十七頁，共48頁。 此外，HLA-B27抗原與白血病、心臟(xnzng)疾病、鼻咽癌、銀屑病、關節(jié)炎型腸炎也有相關性，但相關報道較少 。第28頁/共47頁第二十八頁，共48頁。 名稱易感性等位基因強直性脊柱炎B*

17、2701,B*2702,B*2704,B*2705,B*2710類風濕性關節(jié)炎B*2702, B*2704, B*2705, B*2713青少年自發(fā)性關節(jié)炎B*2724脊椎關節(jié)炎B*2709，B*2705關節(jié)炎型炎癥性腸病B*27XX白塞病B*2702銀屑病B*27XX白血病B*27XX銀屑病B*27XX鼻咽癌B*27XX賴姆疏螺旋體病B*27XXHIV-1感染 B*27XX第29頁/共47頁第二十九頁，共48頁。 3.HLA-B27的檢測(jin c)方法第30頁/共47頁第三十頁，共48頁。 微量淋巴細胞毒實驗(shyn)（CDC） 流式細胞術（FCM） 分子生物學技術（PCR） 第31頁

18、/共47頁第三十一頁，共48頁。 三種檢測方法(fngf)的對比 第32頁/共47頁第三十二頁，共48頁。 HLA-B27基因分型檢測(jin c)方法 特異性引物序列(xli)聚合酶鏈反應 (PCR-SSP) 序列(xli)特異性寡核苷酸-聚合酶鏈反應（PCR-SSO） 聚合酶鏈反應-直接測序分型（PCR-SBT） 第33頁/共47頁第三十三頁，共48頁。 PCR-SSP:針對HLA-B*27基因的外顯子2的序列， 合成相應(xingyng)的HLA-B*27基因引物，在 PCR擴增儀上擴增即可，這種特異性 的PCR擴增產物可通過瓊脂糖凝膠電 泳檢出，凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果。 第34頁/共4

19、7頁第三十四頁，共48頁。 血清學檢測(jin c)HLA-B27抗原的優(yōu)缺點 實驗操作方面（1）經典的血清學分型技術因其操作簡便，準確率 尚可且成本較低，曾得到廣泛應用。 （2）所用標本須為新鮮血液標本。 （3）受細胞純度、補體差異、單抗效價的影響， 易出現錯判漏判，觀察結果存在(cnzi)主觀因素 。 臨床應用方面：血清學檢測的是蛋白抗原，不能檢測出HLA-B*27 等位基因，即血清學結果是陰性，只能說明HLA- B27抗原陰性，并不能確定HLA-B*27基因是否存在(cnzi)。 目前尚無針對HLA-B*27不同等位基因的抗體，故不 能檢測出對應的HLA-B*27等位基因. 第35頁/共

20、47頁第三十五頁，共48頁。 基因學方法(fngf)檢測HLAB*27基因的優(yōu)缺點（以PCR-SSP為例）：實驗操作方面（1）只需PCR擴增儀和瓊脂糖凝膠電泳設備；費用中等， 適合在我國現有條件下開展。 （2）標本需要量少，取材容易，提取的DNA可長期保存； 陳舊血、冷凍血也可用于DNA的提取，使留取標本不 受時間的限制(xinzh)。 （3）結果準確可靠，分析結果客觀，根據內對照及有無特 異性區(qū)帶來判斷結果一目了然。 （4）PCR時要在嚴格的實驗條件下進行，防止污染。臨床應用方面：能直接檢測出HLA-B*27的等位基因，且不同的等位基因 與疾病的相關性大相徑庭，不同等位基因導致的臨床表現 各

21、不相同，適于臨床常規(guī)；第36頁/共47頁第三十六頁，共48頁。 檢測結果不正確主要的危害在于： 檢測結果假陰性：使很多病人在鑒別診斷上缺乏依據； 檢測結果假陽性：使一些病人誤用治療類風濕和強直 性脊椎炎的藥物。 HLA-B27高分辨試劑盒能簡單、快捷的檢測出HLA-B*27等位基因，有效地避免(bmin)了血清學檢測結果的假陰性造成疾病診斷的漏診；同時也能有效地避免(bmin)了檢測結果的假陽性，造成疾病診斷的誤診；同時，直接檢測出的HLA-B*27等位基因與疾病的相關性各不相同，能有效的指導臨床疾病的診斷。第37頁/共47頁第三十七頁，共48頁。 4.本公司(n s)的HLA-B27試劑盒第

22、38頁/共47頁第三十八頁，共48頁。 HLA-B*27篩查試劑盒 HLA-B*27驗證(ynzhng)試劑盒 HLA-B*27高分辨試劑盒第39頁/共47頁第三十九頁，共48頁。 本公司研制的HLA-B*27基因高分辨引物板試劑盒，采用PCR-SSP方法檢測HLA-B*27等位基因，能直接檢測出中國人常見的HLAB*2704、2705、2702、2706、2701、2708、2710等基因，用于AS和其它(qt)相關疾病的輔助診斷。第40頁/共47頁第四十頁，共48頁。 標本要求：標本需要量少（只需6ulDNA即可，DNA最佳濃度 為30-50ng/l，且A260/A280值為（1.8-2.0）， 新鮮血、陳舊血、冷凍血均可。 提取的DNA可于 -200C長期保存。 實驗時間：全部PCR循環(huán)不超過1.5小時 ，整個實驗在2 小時左