1、蛋白酪氨酸磷酸蛋白酪氨酸磷酸酶酶1B1B的缺陷抵的缺陷抵抗抗TGF-TGF-在肝細(xì)在肝細(xì)胞胞中引起的抑中引起的抑制作制作 用用目的 研究研究PTP1BPTP1B在對(duì)在對(duì)TGF-TGF-進(jìn)行細(xì)胞應(yīng)答過程中的作用進(jìn)行細(xì)胞應(yīng)答過程中的作用 意義 對(duì)研究磷酸酶在對(duì)研究磷酸酶在TGF-TGF-信號(hào)通路中的作用開拓了新思路信號(hào)通路中的作用開拓了新思路 簡(jiǎn) 介 實(shí)驗(yàn)相關(guān)技術(shù) 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果 結(jié) 論 內(nèi)容 簡(jiǎn) 介 在肝臟中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-）是一種重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。它在調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的增殖和死亡過程中發(fā)揮重要作用。然而，TGF-也可調(diào)節(jié)形成腫瘤的過程，例如，上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，此過程可導(dǎo)致細(xì)胞遷移、

2、生存、細(xì)胞入侵，免疫調(diào)節(jié)或微環(huán)境的調(diào)節(jié)。 TGF-最終的作用是通過生存信號(hào)的活化而被調(diào)節(jié)，這些信號(hào)依賴于不同的蛋白激酶，例如，表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）或Ras/ERK途徑。這些激酶通常是通過蛋白磷酸酶將其磷酸化來調(diào)節(jié)。在這些酶中，蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是無受體PTP中能廣泛表達(dá)的一員，主要位于有細(xì)胞內(nèi)膜的細(xì)胞器中，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。它的缺乏可抵抗由不同刺激物引起的細(xì)胞死亡 。TGF-信號(hào)途徑中涉及到的酶活性氧組分（ROS） NADPH氧化酶(NOX)PTP1BNF-BTGF-NOX1 實(shí)驗(yàn)方法1、細(xì)胞培養(yǎng) -DEME 2、細(xì)胞數(shù)量分析-crystal violet staining3、

3、細(xì)胞周期的分析-flow cytometry 4、細(xì)胞增殖的測(cè)量-3H-thymidine5、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的測(cè)量氧化作用敏感的熒光探針6、分析凋亡的細(xì)胞核 實(shí)驗(yàn)方法7、caspase-3 活性的分析8、基因表達(dá)的分析semiquantitative PCR Real Time PCR9、蛋白印跡10、免疫細(xì)胞化學(xué)研究11、沉默實(shí)驗(yàn)分析-siRNAreal-time quantitative PCR 指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。應(yīng)用： 1. DNA 或RNA 的絕對(duì)定量分析：包括病原

4、微生物或病毒含量的檢測(cè), 轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，RNAi 基因失活率的檢測(cè)等 。2. 基因表達(dá)差異分析：例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 )，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及cDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證 。3. 基因分型：例如SNP 檢測(cè)，甲基化檢測(cè)等 。常 用 方 法SYBR green:在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。 Taqman Probe:PCR擴(kuò)增時(shí)在加

5、入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5-3外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果 為了研究PTP1B在TGF-信號(hào)途徑中的作用，首先比較野生型和缺陷型細(xì)胞中幾種激酶的基本活性。對(duì)照ERK：細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，將信號(hào)從表面受體傳至核內(nèi)，參與細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡等。AKT：是一種絲氨酸/蘇氨

6、酸蛋白激酶，在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用。結(jié)果：缺陷型細(xì)胞的ERK和AKT磷酸化水平較高 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果野生型和缺陷型細(xì)胞對(duì)TGF-應(yīng)答進(jìn)行比較 結(jié)晶紫染色結(jié)果：經(jīng)36h處理后，野生型細(xì)胞數(shù)量減少，缺陷型細(xì)胞數(shù)量沒有變化 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果據(jù)報(bào)道，經(jīng)TGF-處理后細(xì)胞數(shù)量減少是由于細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制的組合效應(yīng)，所以測(cè)定它在應(yīng)答細(xì)胞因子過程中的作用。結(jié)果：野生型細(xì)胞中TGF-能夠抑制EGF誘導(dǎo)的DNA合成。EGF：表皮生長(zhǎng)因子 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果 測(cè)定caspase3的活性，研究細(xì)胞凋亡情況。小結(jié)： 缺陷型肝細(xì)胞能夠抵制TGF-的抑制作用，如：生長(zhǎng)抑制 細(xì)胞凋亡。 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果 考慮到PTP1B缺乏的

7、肝細(xì)胞能夠抵制TGF-的作用，對(duì)參與細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)過程的分子進(jìn)行研究。首先，證明這些肝細(xì)胞能夠表達(dá)所有參與TGF- 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)過程的蛋白，如，受體，smad蛋白。 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果對(duì)照RT-PCR 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果檢測(cè)smad2和smad3磷酸化水平totalNuclear extracts結(jié)果：缺陷型細(xì)胞中兩者均減少。 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果結(jié)果：磷酸化的Smads轉(zhuǎn)移至核中的量減少。DAPI染色染色原理： 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole)，是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，常用與熒光顯微鏡觀測(cè)。因?yàn)镈API可以透過完整的細(xì)胞膜，它可以用

8、于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果 尋找在抵制TGF-信號(hào)過程中起作用的蛋白激酶，將細(xì)胞與不同蛋白激酶抑制劑共孵育：PD98095LY294002PP2ERK1/2PI3K/AKTSRC 結(jié)果：不能使缺陷型細(xì)胞對(duì)TGF-敏感。 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 當(dāng)一種酪氨酸蛋白激酶抑制劑，gentistein, 加到培養(yǎng)基中時(shí)，表現(xiàn)出對(duì)TGF-產(chǎn)生應(yīng)答。PTP1B缺陷型結(jié)果：genistein能夠抑制AKT和ERK的磷酸化。T+Gen使細(xì)胞數(shù)量降低，并伴隨caspase-3活性增高。Smad2/3磷酸化水平增高。結(jié)果：TGF-的抵制作用與smad2/3的磷酸化降低有關(guān)，但可在酪氨酸蛋白激酶存在下恢

9、復(fù)。 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果 相關(guān)報(bào)道認(rèn)為，NF-B在TGF-信號(hào)途徑中起作用。將p65亞基轉(zhuǎn)移至核中作為NF-B激活的標(biāo)志。結(jié)果：缺陷型細(xì)胞中p65核轉(zhuǎn)移增加。為了研究NF-B途徑在缺陷型細(xì)胞中對(duì)TGF-的抵制作用，用siRNA定向沉默p65。P65的沉默使兩種細(xì)胞對(duì)TGF-作用都敏感。P-Smad2/3增加，smad7下降。核中P-smad2/3顯著增加。然而，在野生型細(xì)胞中，Smads磷酸化水平?jīng)]有受到p65沉默的影響。說明，在PTP1B缺陷型細(xì)胞中，當(dāng)TGF- 存在時(shí)，NF-B活性增加會(huì)抵制TGF-的作用。 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果NOX酶產(chǎn)生的ROS產(chǎn)物是TGF-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中重要的調(diào)節(jié)因子。此

10、外，先前已提出在應(yīng)答TGF-過程中，NF-B與NADPH的關(guān)系。由于這些原因，研究它們?cè)赑TP1B缺陷細(xì)胞對(duì)TGF-的作用是否有影響。分別測(cè)量NOX1和NOX4表達(dá)量下降上升 缺陷型細(xì)胞中，經(jīng)TGF-處理后，NOX酶表達(dá)量不平衡。NOX1表達(dá)下降缺陷型細(xì)胞中以NOX1為目標(biāo)的沉默實(shí)驗(yàn)表達(dá)量下降凋亡的細(xì)胞核增加 P65核轉(zhuǎn)移減少 smad2磷酸化增加 smad7減少以上結(jié)果表明，NOX1活化上調(diào)NF-B的活性。然而，當(dāng)p65被沉默時(shí)NOX1表達(dá)水平下降說明存在一種依賴于NF-B的NOX1表達(dá)的正反饋環(huán)。討 論 TGF-在肝臟病理生理學(xué)中起到雙重作用：抑制和促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。PTP1B的缺乏抵制TG

11、F-的抑制作用，并且與ERK和AKT磷酸化水平升高有關(guān)。經(jīng)TGF-處理后，在缺陷型細(xì)胞中，smad2&3的磷酸化水平下降。PTP1B缺乏時(shí)，由激酶引發(fā)的TGF-抑制作用的損害不能通過簡(jiǎn)單的抑制幾種酶來克服，而當(dāng)一種酪氨酸蛋白激酶抑制劑存在時(shí)，可以觀察到細(xì)胞凋亡。TGF-不僅誘導(dǎo)凋亡前信號(hào)也誘導(dǎo)生存前信號(hào)，而且這些信號(hào)是依賴于NF-B活性。P65沉默實(shí)驗(yàn)證明了NF-B對(duì)TGF-信號(hào)途徑有抑制作用。NOX1被TGF-調(diào)節(jié)似乎與Smads無關(guān)，但與NF-B有關(guān)。NOX1促進(jìn)細(xì)胞生存是通過NF-B的激活，并且NOX1位于NF-B信號(hào)途徑的上游。NF-B誘導(dǎo)產(chǎn)生Smad7可以抑制smad2&am

12、p;3的磷酸化，并且NF-B與smad7的啟動(dòng)子結(jié)合抑制TGF-信號(hào)途徑。結(jié) 果PTP1B的缺乏會(huì)抵制TGF-的抑制作用未來的工作是研究這個(gè)新的途徑在生理學(xué)條件下在激酶過表達(dá)時(shí)的作用，如肝癌等。謝 謝 ！ 實(shí)驗(yàn)方法1、細(xì)胞培養(yǎng) -DEME 2、細(xì)胞數(shù)量分析-crystal violet staining3、細(xì)胞周期的分析-flow cytometry 4、細(xì)胞增殖的測(cè)量-3H-thymidine5、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的測(cè)量氧化作用敏感的熒光探針6、分析凋亡的細(xì)胞核 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果 為了研究PTP1B在TGF-信號(hào)途徑中的作用，首先比較野生型和缺陷型細(xì)胞中幾種激酶的基本活性。對(duì)照ERK：細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，將信號(hào)從表面受體傳至核內(nèi)，參與細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡等。AKT：是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用。結(jié)果：缺陷型細(xì)胞的ERK和AKT磷酸化水平較高 實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果野生型和缺陷型細(xì)胞對(duì)TGF-應(yīng)答進(jìn)行比較 結(jié)晶紫染色結(jié)果：經(jīng)36h處理后，野生型細(xì)胞數(shù)量減少，缺陷