1、第九章第九章 DNADNA序列分析序列分析第一節(jié)第一節(jié) Maxam-GilbertMaxam-Gilbert化學降解法化學降解法第二節(jié)第二節(jié) SangerSanger鏈終止法鏈終止法第三節(jié)第三節(jié) DNADNA片段序列測定的策略片段序列測定的策略第四節(jié)第四節(jié) 核苷酸序列的生物信息分析核苷酸序列的生物信息分析DNA測序測序（DNA sequencing，或譯DNA定序）是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤的（G）排列方式。確定DNA雙股鏈上每一個獨立結構單元或堿基的確切順序。DNA序列的正確測定，是進行基因結構和功能分析，繪制基因圖譜、轉基因檢

2、測等方面工作的重要前提。同時DNA測序技術為快速、簡捷分析蛋白序列及結構提供了工具。DNA測序的發(fā)展測序的發(fā)展：1953年，Watson和Crick推導出DNA雙螺旋結構；1954年，Whitfeld發(fā)明化學降解測序法；1972年，Berg開發(fā)DNA重組技術；1975年，Sanger發(fā)明加減測序法；1977年，Sanger發(fā)明雙脫氧測序法；1986年，第一臺半自動測序儀出現；2000年，Drosophila全基因組測序完成。DNA序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括sanger雙脫氧鏈終止法和maxam-gilbert化學降解法。20實際80年代中期，測序儀出現。發(fā)展至今，自動化測序已成

3、為當今DNA序列分析的主流。美國pe abi公司已生產出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA測序儀，其中310型是臨床檢測實驗室中使用最多的一種型號。最早的測序技術最早的測序技術測序技術最早可以追溯到20世紀50年代，早在1954年就已經出現了關于早期測序技術的報導，即Whitfeld等用化學降解的方法測定多聚核糖核苷酸序列。第一代測序技術誕生第一代測序技術誕生1 9 7 7年S a n g e r等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學降解法，標志著第一代測序技術的誕生。此后， 在S a n g e r 法的基礎上，80年代中期出現了以熒光標記代替放射

4、性同位素標記、以熒光信號接收器和計算機信號分析系統(tǒng)代替放射性自顯影的自動測序儀。另外，90年代中期出現的毛細管電泳技術使得測序的通量大為提高。除此之外，這一時期還出現了一些其他的測序方法，如焦磷酸測序法（pyrosequencing）、連接酶測序法（sequencing byligation, SBL）、雜交測序法（sequencing by hybridization, SBH）等。第二代自動測序技術第二代自動測序技術盡管第一代測序技術已經幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測序方法。經過不斷的開發(fā)和測試，進入2

5、1世紀后，以Roche公司的454技術、Illumina公司的Solexa技術和ABI公司的SOLiD技術為標志的第二代測序技術誕生了。與第一代技術相比，第二代測序技術不僅保持了高準確度，而且大大降低了測序成本并極大地提高了測序速度。使用第一代Sanger的測序技術完成的人類基因組計劃，花費了30億美元巨資，用了三年的時間；然而，使用第二代SOLiD的測序技術，完成一個人的基因組測序現在只需要一周左右的時間。由于第二代測序技術產生的測序結果長度較短，因此比較適合于對已知序列的基因組進行重新測序，而在對全新的基因組進行測序時還需要結合第一代測序技術。第三代基因組測序技術實現單分子速讀第三代基因組

6、測序技術實現單分子速讀據自然雜志網站2月8日報道，在美國佛羅里達州馬可島召開的“基因組生物學與技術進展大會”上，來自加利福尼亞門洛帕克市的太平洋生物科技公司(Pacific Biosciences)介紹了其研制的第三代基因組測序儀，該測序儀實現了一次標記一個分子式的單分子速讀。序列測定的技術序列測定的技術 雜交測序法雜交測序法 質譜法質譜法 單分子測序法單分子測序法 原子探針顯微鏡測序法原子探針顯微鏡測序法DNA 芯片法芯片法 經典方法經典方法:Sanger雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977)Maxam-Gilbert DNA化學降解法化學降解法(Maxam &Gilbert

7、,1977)新技術方法新技術方法:第一節(jié)第一節(jié) Maxam-GilbertMaxam-Gilbert化學降解法化學降解法 化學降解法化學降解法：人們用專一性作用于A、T、G、C堿基的化學藥劑分別處理經內切酶切割而成的一定長度DNA片段，通過控制反應時間，既可獲得分別以A、T、G、C為結尾的四組由所有可能長度核苷酸片段組成的DNA片段群。 除了要研究與DNA的高級結構、DNA-蛋白質結構相關性采用化學降解法外，對于單純對于單純以測序為目的的實驗，普遍采以測序為目的的實驗，普遍采用后面所講的酶促合成法。用后面所講的酶促合成法。 堿基特異性化學切割反應：硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中鳥嘌呤（

8、G）上的N7原子甲基化。肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶環(huán)斷裂；但高鹽條件下，只C斷裂，而不與T反應。哌啶：從修飾甲基處斷裂核苷酸鏈。 在不同的酸、堿、高鹽和低鹽條件下，三種化學試劑按不同組合可以特異地切割核苷酸序列中特定的堿基。G反應：DMS使G在中性和高溫條件下脫落。G+A反應：酸性條件（如甲酸）可使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質子化，利用哌啶使A、G脫落。T+C反應：肼（低鹽）C反應：肼（高鹽） 測定DNA長度250bp?；瘜W裂解法測定化學裂解法測定DNA的核苷酸序列的核苷酸序列第二節(jié)第二節(jié) SangerSanger鏈終止法鏈終止法1977年年Sanger設計了一種通過設計

9、了一種通過DNA復制來識別復制來識別4種堿基的方種堿基的方法，進行法，進行DNA序列測定，即雙脫氧鏈終止法。序列測定，即雙脫氧鏈終止法。Sanger法獲得諾貝爾化學獎。法獲得諾貝爾化學獎。一、Sanger雙脫氧鏈終止法原理在模板指導下，在模板指導下，DNADNA聚合酶不斷將聚合酶不斷將dNTPdNTP加到引物的加到引物的3-OH3-OH末端，末端，使引物延長，合成出新的互補的使引物延長，合成出新的互補的DNADNA鏈，如果加入雙脫氧三磷鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷酸核苷(ddNTP)(ddNTP)，由于雙脫氧核糖的，由于雙脫氧核糖的33位置上缺少一個羥基，位置上缺少一個羥基，故不能同后續(xù)的故不

10、能同后續(xù)的dNTPdNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同相同5-5-引物端和以引物端和以ddNMPddNMP殘基為殘基為33端結尾的一系列長短不端結尾的一系列長短不一片段的混合物。一片段的混合物。由于雙脫氧核苷酸在每個由于雙脫氧核苷酸在每個DNA分子中摻入分子中摻入的位置不同，的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝膠采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個核苷電泳區(qū)分長度差一個核苷酸的單鏈酸的單鏈DNADNA，從而讀取，從而讀取DNADNA核苷酸序列。核苷酸序列。 與與 PCR反應類似。反應類似。反應體系中包含：模板反應體系中包含：模板 DNA, Taq酶酶, dN

11、TPs, ddNTPs和測和測序引物；序引物；反應過程：反應過程： 變性復性延伸終止變性復性延伸終止Sanger雙脫氧終止法雙脫氧終止法Dideoxynucleotides（雙脫氧核苷酸）ddNTPs 是反應終止劑是反應終止劑 可以當作正常堿基參與復制，可以當作正常堿基參與復制，一旦鏈入一旦鏈入DNA中，中，其后就不能再繼續(xù)連接。其后就不能再繼續(xù)連接。反應體系中反應體系中dNTPs的的濃度遠高于濃度遠高于ddNTPs(一般一般34 ：1)。*少一個少一個OH脫氧核甘酸脫氧核甘酸與與雙脫氧核甘酸雙脫氧核甘酸結構比較結構比較H二、雙脫氧終止法測序反應體系二、雙脫氧終止法測序反應體系：DNA聚合酶單

12、鏈DNA模板帶有3-OH末端的單鏈寡核苷酸引物Mg2+4種dNTP (aATP、dGTP、dCTP和dTTP)4種ddNTP (ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP)SangerSanger法法DNADNA測序的試劑測序的試劑 引物：通常由引物：通常由20-2320-23個堿基構成，個堿基構成，G+C=12G+C=12，A+T=8A+T=8到到1111，Tm=60-68Tm=60-68，避免形成引物二聚體或形成發(fā)，避免形成引物二聚體或形成發(fā)卡樣結構卡樣結構 模板模板 DNADNA聚合酶聚合酶 2,3-雙脫氧核苷三磷酸雙脫氧核苷三磷酸（2 2,3,3- -d di id deoxyeo

13、xyn nucleoside ucleoside t tririp phosphate, ddNTPhosphate, ddNTP） dNTPdNTP三、測序反應的種類三、測序反應的種類 引物標記法引物標記法( (Dye primer reactions) 終止物標記法終止物標記法( (Dye terminator reactions)測序過程測序過程: :1. 模板與引物雜交模板與引物雜交2. 引物的延長和合成阻斷引物的延長和合成阻斷四個試管分別加入：四個試管分別加入：DNA聚合酶、聚合酶、dNTPs、標記引、標記引物物終止劑不同：終止劑不同：ddA、ddG、ddC、ddT四個試管中所有產物

14、是一系列長度只差一個核苷酸四個試管中所有產物是一系列長度只差一個核苷酸的聚合鏈的聚合鏈3. 電泳：電泳：ACGT次序，高壓電泳次序，高壓電泳4. 放射自顯影得到直讀圖象放射自顯影得到直讀圖象Sanger第一步：加入復制終止第一步：加入復制終止劑劑熒光檢測探頭熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快ddNTPs參與下的DNA復制SangerSanger法測序產物的平均法測序產物的平均鏈長取決于鏈長取決于ddNTPddNTP與與dNTPdNTP的比例，比例高時，的比例，比例高時，得到較短的產物；得到較短的產物； Gel Electrophoresis DNA Fragment Size Determinati

15、onDNA 帶負電DNA在電泳膠中的遷移率與其片段大小有關Sanger第二步：熒光檢測除核苷酸序列文本文件外，全自動測序儀還提供曲線圖。除核苷酸序列文本文件外，全自動測序儀還提供曲線圖。DNA片斷序列測定的策略片斷序列測定的策略測定未知序列的測定未知序列的DNA片斷片斷一次測序結果有長度限制（一次測序結果有長度限制（1000bp) 通用引物指導未知序列的測定通用引物指導未知序列的測定 引物步移引物步移 隨機克隆測序隨機克隆測序 缺失克隆測序缺失克隆測序通用引物指導未知序列的測定通用引物指導未知序列的測定根據載體序列設計通用引物測定待測根據載體序列設計通用引物測定待測DNA片斷片斷引物步移策略引

16、物步移策略將待測將待測DNADNA片斷克隆在質粒載體上，利用引物步移延伸，從片斷克隆在質粒載體上，利用引物步移延伸，從D DNANA片斷的一端開始逐步進行序列測定，直至另一端為止。片斷的一端開始逐步進行序列測定，直至另一端為止?？朔锁B槍法的盲目性，并省去亞克隆制備步驟，也減輕了克服了鳥槍法的盲目性，并省去亞克隆制備步驟，也減輕了數據分析工作量。數據分析工作量。但由于測定下一段序列前要預先知道上游序列的堿基順序，但由于測定下一段序列前要預先知道上游序列的堿基順序，才能合成適當的引物進行測序。才能合成適當的引物進行測序。定向缺失克隆策略、染色體步查法等。定向缺失克隆策略、染色體步查法等。鳥槍測序

17、法鳥槍測序法(shotgun sequencing)(shotgun sequencing)：隨機克隆測序：隨機克隆測序 將待測的將待測的DNADNA片段隨機打斷片段隨機打斷并構建隨機重疊克隆文庫并構建隨機重疊克隆文庫，然后，然后通過通過通用引物測定通用引物測定每個克隆中的待測每個克隆中的待測DNADNA序列。當這些已測序列序列。當這些已測序列的數量達到一定程度后，相當于待測的數量達到一定程度后，相當于待測DNADNA片斷的每一部位的序列片斷的每一部位的序列也就被測定出來了，通過這些所測序列之間的也就被測定出來了，通過這些所測序列之間的重疊部分重疊部分，最終，最終可將整個可將整個DNADNA片

18、斷的序列拼接出來，這樣的測序策略稱為隨機克片斷的序列拼接出來，這樣的測序策略稱為隨機克隆測序。隆測序。 將將DNADNA大片段切割成小片段大片段切割成小片段的的三種方法：三種方法： 限制性內切酶限制性內切酶酶切酶切 超聲波處理超聲波處理 DNADNA酶酶I I降解降解( (加加MnMn2+2+) )鳥槍法測序的缺點鳥槍法測序的缺點隨著所測基因組總量增大，所需測序的片段大量隨著所測基因組總量增大，所需測序的片段大量增加，造成重復測定，也易丟失某些序列，且數增加，造成重復測定，也易丟失某些序列，且數據處理分析工作量大。據處理分析工作量大。高等真核生物（如人類）基因組中有大量重復序高等真核生物（如人

19、類）基因組中有大量重復序列，導致判斷失誤。列，導致判斷失誤。完整基因組的測序過程一般包括三個步驟：完整基因組的測序過程一般包括三個步驟：（1 1）建立克隆的物理圖譜：如酵母人工染色體）建立克隆的物理圖譜：如酵母人工染色體YACYAC（Yeast Yeast Artificial ChromosomeArtificial Chromosome）克隆、細菌人工染色體克隆、細菌人工染色體BACBAC（Bacterial Artificial ChromosomeBacterial Artificial Chromosome）克隆等；克隆等；（2 2）利用鳥槍法（）利用鳥槍法（Shotgun Stra

20、tegyShotgun Strategy）測定每個克隆的序列；測定每個克隆的序列；（3 3）序列拼裝和注釋：當得到一段）序列拼裝和注釋：當得到一段DNADNA序列之后，可以利用序序列之后，可以利用序列分析工具，進行序列的拼接；繼而通過與數據庫序列的比較，列分析工具，進行序列的拼接；繼而通過與數據庫序列的比較，得到與該序列相關的信息，如基因、調控元件、重復區(qū)域等，得到與該序列相關的信息，如基因、調控元件、重復區(qū)域等，進而對序列的生物學特性進行注釋。進而對序列的生物學特性進行注釋。 基因組測序基因組測序DNA全序列全序列切成切成小段小段小段和載體結合小段和載體結合結合后進行測序結合后進行測序Map

21、 fragmentsSequence overlappingfragmentsAssembledsequence基因組基因組DNA序列測定示意圖序列測定示意圖 通過隨機剪切得到的大分子通過隨機剪切得到的大分子DNA片段克隆到載體上。繪片段克隆到載體上。繪制出這些重疊片段的圖譜，并對重疊片段進行測序，通過制出這些重疊片段的圖譜，并對重疊片段進行測序，通過“拼裝拼裝”得到基因組序列。另一種方法不是根據片段的染色得到基因組序列。另一種方法不是根據片段的染色體位置，而是根據其重疊部分進行體位置，而是根據其重疊部分進行“拼裝拼裝”。Sequence all fragments and assemble四

22、、大規(guī)模四、大規(guī)模DNA測序的趨勢自動化測序的趨勢自動化DNA測序實現規(guī)?；闹匾獥l件是自動化和機械化。測序實現規(guī)?；闹匾獥l件是自動化和機械化。目前，目前，DNA制備、克隆文庫組建及篩選、制備、克隆文庫組建及篩選、DNA測序測序分析、數據的分析獲得、堿基序列閱讀、重疊克隆分析、數據的分析獲得、堿基序列閱讀、重疊克隆群順序排定等過程群順序排定等過程 均已平行發(fā)展，自動化操作緊隨均已平行發(fā)展，自動化操作緊隨其后。隨著其后。隨著DNA測序不斷由半自動化向自動化過渡，測序不斷由半自動化向自動化過渡，原始數據積累將不成問題，關鍵是把全基因的散測原始數據積累將不成問題，關鍵是把全基因的散測序組裝起來，以

23、實現序組裝起來，以實現DNA測序的完整性。目前，在測序的完整性。目前，在亞克隆篩選、模板制備、測序反應、堿基閱讀等方亞克隆篩選、模板制備、測序反應、堿基閱讀等方面均在一定程度上實現了自動化。面均在一定程度上實現了自動化。1、克隆篩選克隆篩選從亞克隆文庫中尋找并篩選單一克隆已逐步實現了自動化。從亞克隆文庫中尋找并篩選單一克隆已逐步實現了自動化。 2、模板制備模板制備 現有的機器人被用來自動分離現有的機器人被用來自動分離DNA并制備適于傳統(tǒng)操作程度的并制備適于傳統(tǒng)操作程度的測序模板。特定用途的測序模板。特定用途的DNA分離儀也已采用。分離儀也已采用。3、測序反應測序反應由于手工測序不能保證所需的再

24、生產能力、高通量和準確的重由于手工測序不能保證所需的再生產能力、高通量和準確的重復性，所以，復性，所以，DNA測序反應的自動化對大規(guī)模測序是至關測序反應的自動化對大規(guī)模測序是至關重要的。重要的。4、自動放射性自顯影閱讀機自動放射性自顯影閱讀機近幾年來，自動化放射性自顯影閱讀機紛紛上市，并不斷向商近幾年來，自動化放射性自顯影閱讀機紛紛上市，并不斷向商業(yè)化及科研應用方向發(fā)展。業(yè)化及科研應用方向發(fā)展。 5、自動測序儀自動測序儀DNA自動測序儀的應用實現了凝膠電泳、初始數據獲取、堿基自動測序儀的應用實現了凝膠電泳、初始數據獲取、堿基閱讀等步驟自動化閱讀等步驟自動化 。310型全自動遺傳分析儀型全自動遺

25、傳分析儀DNA全自動分析儀：全自動分析儀：ABI Prism 3100遺傳分析儀遺傳分析儀 3700型全自動遺傳分析儀型全自動遺傳分析儀安瑪西亞安瑪西亞DNA序列分析系統(tǒng)型號：序列分析系統(tǒng)型號：MegaBACE 500/1000/4000 分析儀器的新發(fā)展：分析儀器的新發(fā)展： 377型遺傳分析儀型遺傳分析儀 3730型遺傳分析儀型遺傳分析儀 377型型DNA全自動測序儀采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，結合美全自動測序儀采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，結合美國應用生物系統(tǒng)國應用生物系統(tǒng)(ABI)公司專利的四色熒光標記，激光檢測，一公司專利的四色熒光標記，激光檢測，一個泳道檢測的方法，一個測序反應保證個泳道檢測的

26、方法，一個測序反應保證500bp的準確序列。的準確序列。 3730型型DNA全自動測序儀采用毛細管電泳，速度更快，效全自動測序儀采用毛細管電泳，速度更快，效果更好，通量更大，一個測序反應保證果更好，通量更大，一個測序反應保證800bp的準確序列，是當的準確序列，是當前基因測序的主打。前基因測序的主打。優(yōu)點優(yōu)點：i. 四個反應系統(tǒng)可合并點樣，大大節(jié)省制膠和點樣時間；四個反應系統(tǒng)可合并點樣，大大節(jié)省制膠和點樣時間； ii. 可同時讀出多個樣品核苷酸序列，不需干燥凝膠和放射可同時讀出多個樣品核苷酸序列，不需干燥凝膠和放射自顯影；自顯影； iii.可連續(xù)電泳，可讀出較多的核苷酸序列?？蛇B續(xù)電泳，可讀出較多的核苷酸序列。缺點缺點：無法保留原始記錄：無法保留原始記錄, 四個反應產物點在一條道上四個反應產物點在一條道上, 相互間會相互間會發(fā)生干擾發(fā)生干擾, 導致讀序時分辨率下降。導致讀序時分辨率下降。+光擴增量計算機激光儀(氬離子)窗口DNA序列分析自動化包括兩序列分析自動化包括兩個方面的內容，一是指個方面的內容，一是指“分分析反應析反應”的自動化，另一方的自動化，另一方面則是指面則是指“讀