1、植物原生質(zhì)體培養(yǎng)植物原生質(zhì)體培養(yǎng) 煙草煙草151 李春黎李春黎01植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的定義及其應(yīng)用定義及其應(yīng)用原生質(zhì)體概況原生質(zhì)體概況 植物原生質(zhì)體研究進(jìn)展植物原生質(zhì)體研究進(jìn)展1960年，年，Cocking首次應(yīng)用酶法制備番茄根原生質(zhì)體獲首次應(yīng)用酶法制備番茄根原生質(zhì)體獲得成功。得成功。1968年，年，Takebe et al.首次獲得煙草葉肉原生質(zhì)體培首次獲得煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株。養(yǎng)再生植株。1985年，年，F(xiàn)ujimura et al.世界第一例禾谷類作物水稻世界第一例禾谷類作物水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得再生植株。原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得再生植株。應(yīng)用：應(yīng)用：1.體細(xì)胞雜交：實現(xiàn)遠(yuǎn)

2、緣物種的體細(xì)胞雜交，體細(xì)胞雜交：實現(xiàn)遠(yuǎn)緣物種的體細(xì)胞雜交，再通過植株再生就可能創(chuàng)造出新的植物個再通過植株再生就可能創(chuàng)造出新的植物個體體2.遺傳轉(zhuǎn)化：實現(xiàn)外源遺傳轉(zhuǎn)化：實現(xiàn)外源DNA或細(xì)胞器的導(dǎo)入，或細(xì)胞器的導(dǎo)入，通過植株再生就可以得到轉(zhuǎn)基因植物通過植株再生就可以得到轉(zhuǎn)基因植物3.分離細(xì)胞器的理想材料分離細(xì)胞器的理想材料4.無性系變異及突變體的篩選無性系變異及突變體的篩選植物原生質(zhì)體的分離植物原生質(zhì)體的分離02（一）原生質(zhì)體的分離與收集（一）原生質(zhì)體的分離與收集 高產(chǎn)量、高質(zhì)量的原生質(zhì)體是進(jìn)行原生質(zhì)高產(chǎn)量、高質(zhì)量的原生質(zhì)體是進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)和操作的前提。體培養(yǎng)和操作的前提。 步驟：步驟： 1.材

3、料的選擇；材料的選擇； 2.酶解處理；酶解處理； 3.原生質(zhì)體的分離、純化；原生質(zhì)體的分離、純化； 4.原生質(zhì)體的活力檢測。原生質(zhì)體的活力檢測。1、材料的選擇、材料的選擇1）取材）取材 細(xì)胞分裂旺盛的材料細(xì)胞分裂旺盛的材料 雙子葉植物：幼嫩小苗的根、胚軸、子葉、幼葉雙子葉植物：幼嫩小苗的根、胚軸、子葉、幼葉 單子葉植物（禾本科植物）：愈傷組織或懸浮細(xì)單子葉植物（禾本科植物）：愈傷組織或懸浮細(xì)胞胞 2）預(yù)處理：）預(yù)處理：有菌材料，必須進(jìn)行表面消毒處理；有菌材料，必須進(jìn)行表面消毒處理；暗處理；暗處理；葉片萎蔫處理，撕去下表皮；葉片萎蔫處理，撕去下表皮；質(zhì)壁分離處理；質(zhì)壁分離處理；懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞o

4、r愈傷組織預(yù)培養(yǎng)。愈傷組織預(yù)培養(yǎng)。2、 酶解處理酶解處理 配制酶解液配制酶解液酶解酶解 酶酶酶溶劑（膜穩(wěn)定劑，酶溶劑（膜穩(wěn)定劑，pH穩(wěn)定劑）穩(wěn)定劑）滲透壓穩(wěn)定劑滲透壓穩(wěn)定劑無機(jī)離子：提高質(zhì)膜的穩(wěn)定性；也可以提高原生質(zhì)無機(jī)離子：提高質(zhì)膜的穩(wěn)定性；也可以提高原生質(zhì)體活力體活力牛血清白蛋白：防止酶解過程對細(xì)胞膜和細(xì)胞器的牛血清白蛋白：防止酶解過程對細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞破壞pH緩沖劑：保持酶解液的酸堿環(huán)境的穩(wěn)定，增加原緩沖劑：保持酶解液的酸堿環(huán)境的穩(wěn)定，增加原生質(zhì)體的釋放量和原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。生質(zhì)體的釋放量和原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。 滲透壓調(diào)節(jié)劑滲透壓調(diào)節(jié)劑目的：維持等滲環(huán)境，保證釋放出來的原生質(zhì)目的：維持

5、等滲環(huán)境，保證釋放出來的原生質(zhì)體的活力和膜穩(wěn)定性體的活力和膜穩(wěn)定性常用物質(zhì)：葡萄糖、甘露醇和山梨醇等，濃度常用物質(zhì)：葡萄糖、甘露醇和山梨醇等，濃度一般為一般為0.35-0.8mol/L。具體用什么濃度，要。具體用什么濃度，要根據(jù)材料的特點來確定。根據(jù)材料的特點來確定。酶解液配制好后，要用過濾滅菌的方法進(jìn)行酶解液配制好后，要用過濾滅菌的方法進(jìn)行滅菌，并且隨配隨用滅菌，并且隨配隨用 酶解酶解將無菌材料放入酶解液中處理以釋放出原生將無菌材料放入酶解液中處理以釋放出原生質(zhì)體的過程質(zhì)體的過程原則：利用盡可能低的酶濃度和酶解時間獲原則：利用盡可能低的酶濃度和酶解時間獲得大量而有活力的原始質(zhì)體得大量而有活力

6、的原始質(zhì)體條件：材料與酶解液的比例為條件：材料與酶解液的比例為1g/10-20ml酶酶解液；一般在解液；一般在pH5.4 6.0、25-30、黑暗黑暗中振蕩（中振蕩（3050r/m）酶解）酶解30min幾十幾十hours。苜蓿葉片苜蓿葉片的酶解法的酶解法分離原生分離原生質(zhì)體質(zhì)體3、原生質(zhì)體的收集與純化、原生質(zhì)體的收集與純化目的：除去未去壁的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、葉綠體、微目的：除去未去壁的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、葉綠體、微管成分和細(xì)胞團(tuán)等組織殘渣；殘余酶液管成分和細(xì)胞團(tuán)等組織殘渣；殘余酶液預(yù)處理：酶解結(jié)束后，將酶解物通過孔徑為預(yù)處理：酶解結(jié)束后，將酶解物通過孔徑為20-70m的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去未被酶解的

7、組織塊的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去未被酶解的組織塊和細(xì)胞團(tuán)，收集濾液于離心管中和細(xì)胞團(tuán)，收集濾液于離心管中純化方法：純化方法：沉降法：用甘露醇作滲透壓調(diào)節(jié)劑和離心介質(zhì)，將沉降法：用甘露醇作滲透壓調(diào)節(jié)劑和離心介質(zhì)，將收集的濾液低速離心，使收集的濾液低速離心，使原生質(zhì)體沉于管底原生質(zhì)體沉于管底漂浮法：用蔗糖作滲透壓調(diào)節(jié)劑和離心介質(zhì)，將收漂浮法：用蔗糖作滲透壓調(diào)節(jié)劑和離心介質(zhì)，將收集的濾液提高速度離心，使集的濾液提高速度離心，使原生質(zhì)體漂浮于溶液原生質(zhì)體漂浮于溶液表面表面，細(xì)胞碎片等雜質(zhì)沉于管底，細(xì)胞碎片等雜質(zhì)沉于管底界面法：利用比重不同的溶液，經(jīng)離心后使完整無界面法：利用比重不同的溶液，經(jīng)離心后使完整無

8、損的損的原生質(zhì)體處在兩液相的界面原生質(zhì)體處在兩液相的界面之間，而細(xì)胞碎之間，而細(xì)胞碎片等雜質(zhì)沉于管底。片等雜質(zhì)沉于管底。苜蓿葉片原生苜蓿葉片原生質(zhì)體的純化質(zhì)體的純化完整的原生完整的原生質(zhì)體質(zhì)體苜蓿葉苜蓿葉片的原片的原生質(zhì)體生質(zhì)體4、原生質(zhì)體活力的測定、原生質(zhì)體活力的測定熒光素雙醋酸酯（熒光素雙醋酸酯（fluorescein diacetate，F(xiàn)DA）染色法染色法 原生質(zhì)體活力（原生質(zhì)體活力（%）=發(fā)熒光的原生質(zhì)體數(shù)發(fā)熒光的原生質(zhì)體數(shù)/原原生質(zhì)體總數(shù)生質(zhì)體總數(shù)100%FDA活細(xì)胞活細(xì)胞脂酶分解脂酶分解有極性熒光素積累有極性熒光素積累紫外光照射紫外光照射綠色熒光綠色熒光 胞質(zhì)環(huán)流檢測法：以胞質(zhì)環(huán)

9、流作為進(jìn)行活躍代謝的指標(biāo)03原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng) 1 、培養(yǎng)基培養(yǎng)基原生質(zhì)體培養(yǎng)基基本上是參照植物組織或細(xì)胞原生質(zhì)體培養(yǎng)基基本上是參照植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基。培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基。茄科植物：茄科植物：MS、NT十字花科和豆科：十字花科和豆科：B5、KM8P禾本科：禾本科：MS、N6 、KM8P無機(jī)鹽：無機(jī)鹽：大量元素應(yīng)比愈傷組織培養(yǎng)基中的濃度低；大量元素應(yīng)比愈傷組織培養(yǎng)基中的濃度低；由于由于Ca2+影響到膜的穩(wěn)定性，因此較高影響到膜的穩(wěn)定性，因此較高Ca2+的對原生質(zhì)體分裂有利。的對原生質(zhì)體分裂有利。 有機(jī)成分：有機(jī)成分：原生質(zhì)體培養(yǎng)時要求培養(yǎng)基原生質(zhì)體培養(yǎng)時要

10、求培養(yǎng)基豐富的有機(jī)成分豐富的有機(jī)成分，如氨基酸、維生素、如氨基酸、維生素、CM，YE，LH，CH、小牛、小牛血清等。血清等。（3）激素：）激素：培養(yǎng)基中要加入一定濃度的培養(yǎng)基中要加入一定濃度的細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素和和生長素生長素 滲透壓穩(wěn)定劑：滲透壓穩(wěn)定劑：培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中必須使用滲透壓調(diào)節(jié)劑，必須使用滲透壓調(diào)節(jié)劑，以維持原生質(zhì)以維持原生質(zhì)體的穩(wěn)定。體的穩(wěn)定。 等滲或者低于細(xì)胞內(nèi)的滲透壓等滲或者低于細(xì)胞內(nèi)的滲透壓（5 5）碳源）碳源-葡萄糖葡萄糖2、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方式：、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方式： 固體培養(yǎng)固體培養(yǎng) （平板培養(yǎng)）（平板培養(yǎng)）瓊脂培養(yǎng)基與原生質(zhì)體溶液混合搖勻，倒平板，瓊脂培養(yǎng)基與原生質(zhì)

11、體溶液混合搖勻，倒平板，薄層培養(yǎng)。薄層培養(yǎng)。特點：容易觀察、統(tǒng)計原生質(zhì)體的分裂情況特點：容易觀察、統(tǒng)計原生質(zhì)體的分裂情況，但，但操作比較復(fù)雜。操作比較復(fù)雜。進(jìn)行平板培養(yǎng)時，要注意混合時培養(yǎng)基的溫度；進(jìn)行平板培養(yǎng)時，要注意混合時培養(yǎng)基的溫度；平板培養(yǎng)在以后添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物平板培養(yǎng)在以后添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物方面也要復(fù)雜些。方面也要復(fù)雜些。液體淺層培養(yǎng)液體淺層培養(yǎng)將含原生質(zhì)體的培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿底部，使其成一薄層將含原生質(zhì)體的培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿底部，使其成一薄層，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。特點：特點：操作簡單操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，而且方便以后添加新，對原生質(zhì)體的損傷小，而

12、且方便以后添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間粘連粘連，從，從而影響其進(jìn)一步的生長、分裂而影響其進(jìn)一步的生長、分裂原生質(zhì)體的位置原生質(zhì)體的位置不能固定不能固定，所以不能跟蹤觀察單個原生，所以不能跟蹤觀察單個原生質(zhì)體的生長過程。質(zhì)體的生長過程。液體液體固體結(jié)合培養(yǎng)固體結(jié)合培養(yǎng)液體淺層液體淺層固體平板培養(yǎng)雙層培養(yǎng)法固體平板培養(yǎng)雙層培養(yǎng)法培養(yǎng)皿底部鋪一層瓊脂或瓊脂糖培養(yǎng)基，再將原生培養(yǎng)皿底部鋪一層瓊脂或瓊脂糖培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液倒入或滴入固體培養(yǎng)基表面。質(zhì)體懸浮液倒入或滴入固體培養(yǎng)基表面。特點：固體培養(yǎng)基

13、中的特點：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)可以緩慢釋放到液體培營養(yǎng)可以緩慢釋放到液體培養(yǎng)基中養(yǎng)基中如果在固體培養(yǎng)基中加入活性炭，還可以吸附培養(yǎng)如果在固體培養(yǎng)基中加入活性炭，還可以吸附培養(yǎng)物分泌的有毒物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的生長和分裂物分泌的有毒物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的生長和分裂（4）瓊脂糖珠培養(yǎng)：）瓊脂糖珠培養(yǎng)：用移液管吸取含原生質(zhì)體的瓊脂糖培養(yǎng)基，用移液管吸取含原生質(zhì)體的瓊脂糖培養(yǎng)基，滴在三角瓶中，待其凝固后，再加入適量滴在三角瓶中，待其凝固后，再加入適量的液體培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。的液體培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。特點：特點：改進(jìn)改進(jìn)了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進(jìn)可以促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂及細(xì)

14、胞團(tuán)而促進(jìn)可以促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂及細(xì)胞團(tuán)的形成。的形成。3、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)條件植板密度：植板密度：104 105個個/mL散射光或黑暗散射光或黑暗溫度：溫度：25 30 （三）原生質(zhì)體的發(fā)育和植株再生（三）原生質(zhì)體的發(fā)育和植株再生原生質(zhì)體原生質(zhì)體 形成新的細(xì)胞壁形成新的細(xì)胞壁 第一次分裂第一次分裂 小細(xì)胞團(tuán)小細(xì)胞團(tuán) 愈傷組織愈傷組織 再生苗再生苗1 細(xì)胞壁再生細(xì)胞壁再生原生質(zhì)體數(shù)小時后開始形成新的細(xì)胞壁，一至數(shù)天內(nèi)原生質(zhì)體數(shù)小時后開始形成新的細(xì)胞壁，一至數(shù)天內(nèi)便可形成完整的細(xì)胞壁便可形成完整的細(xì)胞壁2 細(xì)胞分裂和生長細(xì)胞分裂和生長在細(xì)胞分裂開始以后，培養(yǎng)基中的甘露醇或山梨醇的在細(xì)胞分裂開始以后，培養(yǎng)基中的甘露醇或山梨醇的濃度要逐漸濃度要逐漸降低降低，否則會影響細(xì)胞的繼續(xù)生長、分，否則會影響細(xì)胞的繼續(xù)生長、分裂。裂。新細(xì)胞新細(xì)胞2-7d第一次分裂第一次分裂2w后后多細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)多細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)3w后后小細(xì)胞克隆小細(xì)胞克隆約約6w后后直徑直徑1mm的小愈傷組織的小愈傷組織低滲透壓