1、第第二二章章 電泳學(xué)基礎(chǔ)電泳學(xué)基礎(chǔ)一、一、定義及原理1 1、電泳：、電泳：是指帶電粒子在電場(chǎng)中向與其自身帶相反電荷的電極移動(dòng)是指帶電粒子在電場(chǎng)中向與其自身帶相反電荷的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。的現(xiàn)象。2 2、原理、原理 電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、性狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同電性質(zhì)以及分子本身大小、性狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純。的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純。 遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的遷移率與帶電

2、分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的黏度成反比。黏度成反比。3 3、應(yīng)用：、應(yīng)用：電泳技術(shù)除了用于小分子物質(zhì)電泳技術(shù)除了用于小分子物質(zhì) ( (無機(jī)鹽、氨基酸、核苷酸、無機(jī)鹽、氨基酸、核苷酸、脂類脂類) )的分離分析外，最主要用于生物大分子的分離分析外，最主要用于生物大分子 ( (蛋白質(zhì)、核酸、酶蛋白質(zhì)、核酸、酶) ) 的研究。的研究。以生物大分子為例闡明電荷來源以生物大分子為例闡明電荷來源RCOOHNH3+RCOO-NH3+RCOO-NH2+ OH- + H+ OH- + H+ pHpIpH=pIpH3Si-O- + H+Si-OH硅羥基的電離硅羥基的電離SiO-SiSiO-SiSiO

3、-SiO-SiOOO-O-O-HHHHHHH毛細(xì)管內(nèi)液體毛細(xì)管內(nèi)液體當(dāng)毛細(xì)管內(nèi)充滿水時(shí)，會(huì)出現(xiàn)雙電層：當(dāng)毛細(xì)管內(nèi)充滿水時(shí)，會(huì)出現(xiàn)雙電層：SiOSiSiOSiSiOSiOSiOOOOOHHHNa+Na+Na+Na+毛細(xì)管內(nèi)液體毛細(xì)管內(nèi)液體當(dāng)毛細(xì)管內(nèi)液體為當(dāng)毛細(xì)管內(nèi)液體為pH 7.0 磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉緩沖磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉緩沖液液-電滲和電泳電滲和電泳+v電滲電滲 電滲是一種電滲是一種液體相對(duì)于帶電管壁移動(dòng)液體相對(duì)于帶電管壁移動(dòng)的現(xiàn)象。水合離子的現(xiàn)象。水合離子引起的流體整體移動(dòng)。引起的流體整體移動(dòng)。是毛細(xì)管內(nèi)液體及其中是毛細(xì)管內(nèi)液體及其中所有組分共有所有組分共有的現(xiàn)象，包括溶劑、各種溶質(zhì)

4、（帶電離子與中性分子）的現(xiàn)象，包括溶劑、各種溶質(zhì)（帶電離子與中性分子）v電泳電泳 電泳是帶電離子在電場(chǎng)作用下的定向移動(dòng)。是電泳是帶電離子在電場(chǎng)作用下的定向移動(dòng)。是毛細(xì)管毛細(xì)管內(nèi)帶電離子內(nèi)帶電離子的特有現(xiàn)象，中性分子無電泳現(xiàn)象。的特有現(xiàn)象，中性分子無電泳現(xiàn)象。SiOSiSiOSiSiOSiOSiOOOOO-Na+Cl-電滲電滲電泳電泳電泳電泳 遷移速度遷移速度Na+Cl-矢量速度矢量速度合速度合速度+隨著遷移速度不同，逐漸形成樣品譜帶隨著遷移速度不同，逐漸形成樣品譜帶,依次在檢測(cè)依次在檢測(cè)窗口被檢測(cè)窗口被檢測(cè)Na+Cl-+Na+Cl-Na+Cl-+毛細(xì)管電泳區(qū)帶電泳法分離硝基苯酚毛細(xì)管電泳區(qū)帶電

5、泳法分離硝基苯酚 對(duì)硝基苯酚對(duì)硝基苯酚 7.15鄰硝基苯酚鄰硝基苯酚 7.22間硝基苯酚間硝基苯酚 8.39 pKa硝基苯酚的電離硝基苯酚的電離O-NO2OHNO2電離后，硝基苯酚負(fù)電荷含量硝基苯酚受電場(chǎng)作用力pKa 對(duì)對(duì)鄰鄰鄰鄰間間F 對(duì)對(duì)鄰鄰間間電泳速度電泳速度 對(duì)對(duì)鄰鄰間間電滲速度不變合速度合速度 對(duì)對(duì)鄰鄰間間出峰順序：間、鄰、對(duì)出峰順序：間、鄰、對(duì)2、等速電泳等速電泳(ITP)等速現(xiàn)象：等速現(xiàn)象：電泳靜態(tài)達(dá)到后，被分離的離子淌度按順序性梯電泳靜態(tài)達(dá)到后，被分離的離子淌度按順序性梯形遞減。形遞減。1964年，由于年，由于Everaerts和和Martin的重要貢獻(xiàn)，的重要貢獻(xiàn)，ITP正式

6、誕生。正式誕生。在研究中，他們發(fā)現(xiàn)在在研究中，他們發(fā)現(xiàn)在ITP達(dá)到靜態(tài)后，所有被分離的離子以達(dá)到靜態(tài)后，所有被分離的離子以相同的速度移動(dòng)。因此，他們命名這一分離工具為相同的速度移動(dòng)。因此，他們命名這一分離工具為iso-tach-phoresis (iso = equal = 相等，相等，tach = velocity = 速度，速度， phoresis = electrophoresis = 電泳電泳)。 1. 1. 將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導(dǎo)離子將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導(dǎo)離子( (充滿充滿毛細(xì)管毛細(xì)管) )和尾隨離子（置于一端的電泳槽中），試樣離子的和尾隨離子（置于一

7、端的電泳槽中），試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動(dòng)。淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動(dòng)。 2. 2. 前導(dǎo)電解質(zhì)的遷移率高于任何樣品組分，后者則低于前導(dǎo)電解質(zhì)的遷移率高于任何樣品組分，后者則低于任何樣品組分，被分離的組分按其不同的遷移率夾在中間，任何樣品組分，被分離的組分按其不同的遷移率夾在中間，在強(qiáng)電場(chǎng)的作用下，各被分離組分在前導(dǎo)電解質(zhì)與尾隨電解在強(qiáng)電場(chǎng)的作用下，各被分離組分在前導(dǎo)電解質(zhì)與尾隨電解質(zhì)之間的空隙中移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)分離。質(zhì)之間的空隙中移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)分離。等速電泳等速電泳圖示圖示 3. 3. 不同離子的淌度不同，不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場(chǎng)強(qiáng)度不同所形成區(qū)帶的電場(chǎng)強(qiáng)

8、度不同(=(=m mE E) )，淌度大的離子區(qū)帶，淌度大的離子區(qū)帶電場(chǎng)強(qiáng)度小。電場(chǎng)強(qiáng)度小。 n在等速電泳達(dá)到靜態(tài)后，所有的被分離的區(qū)帶以相同的速度在等速電泳達(dá)到靜態(tài)后，所有的被分離的區(qū)帶以相同的速度向前移動(dòng)，移動(dòng)最快的離子為向前移動(dòng)，移動(dòng)最快的離子為前導(dǎo)離子前導(dǎo)離子（leading ionleading ion），遷），遷移最慢的離子為移最慢的離子為尾隨離子尾隨離子（terminating ionterminating ion），其它遷移速），其它遷移速度介于兩者之間的離子按速度大小依次分離。分離后的區(qū)帶度介于兩者之間的離子按速度大小依次分離。分離后的區(qū)帶為近矩形，不同離子的區(qū)帶與區(qū)帶之間為

9、為近矩形，不同離子的區(qū)帶與區(qū)帶之間為“肩并肩肩并肩”的形式。的形式。n在等速電泳中，區(qū)帶之間的界面是非常清晰的。這是由于存在等速電泳中，區(qū)帶之間的界面是非常清晰的。這是由于存在在“自校正效應(yīng)自校正效應(yīng)” ” 或或“自銳利效應(yīng)自銳利效應(yīng)” ” 。如果前導(dǎo)離子擴(kuò)散。如果前導(dǎo)離子擴(kuò)散進(jìn)入鄰近的區(qū)帶，由于前導(dǎo)離子淌度高于鄰近的離子淌度，進(jìn)入鄰近的區(qū)帶，由于前導(dǎo)離子淌度高于鄰近的離子淌度，在鄰近區(qū)帶內(nèi)前導(dǎo)離子速度會(huì)高于鄰近離子速度，結(jié)果擴(kuò)散在鄰近區(qū)帶內(nèi)前導(dǎo)離子速度會(huì)高于鄰近離子速度，結(jié)果擴(kuò)散進(jìn)入鄰近區(qū)帶的前導(dǎo)離子重新遷移回自己的區(qū)帶。分析其它進(jìn)入鄰近區(qū)帶的前導(dǎo)離子重新遷移回自己的區(qū)帶。分析其它離子的擴(kuò)散

10、遷移會(huì)得到類似的結(jié)果。離子的擴(kuò)散遷移會(huì)得到類似的結(jié)果。n特點(diǎn)：界面明顯，富集、濃縮作用。特點(diǎn)：界面明顯，富集、濃縮作用。等電聚焦電泳等電聚焦電泳等電聚焦電泳（等電聚焦電泳（IFE，isoelectric focusing electrophoresis）：）： 利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質(zhì)）在凝膠（常用聚利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質(zhì)）在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）內(nèi)制造一個(gè)丙烯酰胺凝膠）內(nèi)制造一個(gè)pH梯度，電泳時(shí)每種蛋白質(zhì)就將梯度，電泳時(shí)每種蛋白質(zhì)就將遷移到等于其遷移到等于其等電點(diǎn)（等電點(diǎn)（pI）的）的pH處（此時(shí)此蛋白質(zhì)不再帶有處（此時(shí)此蛋白質(zhì)不再帶有凈的正或負(fù)電荷），凈的正或負(fù)電荷）

11、，最后，樣品的各組分在各自的等電點(diǎn)聚最后，樣品的各組分在各自的等電點(diǎn)聚焦成一條清晰而穩(wěn)定的窄帶。焦成一條清晰而穩(wěn)定的窄帶。 Pr為兩性電解質(zhì)，為兩性電解質(zhì)，不同不同Pr的的pI不同，不同，pI范圍窄且凈電荷范圍窄且凈電荷為零，因此依為零，因此依pI分離分離Pr。 EF是在凝膠中加兩性載體電解質(zhì)，通直流電后，可形成是在凝膠中加兩性載體電解質(zhì)，通直流電后，可形成從陽(yáng)極到陰極逐步增加的從陽(yáng)極到陰極逐步增加的pH梯度梯度(連續(xù)的連續(xù)的,穩(wěn)定的穩(wěn)定的,線性的線性的pH)。 當(dāng)當(dāng)Pr在電場(chǎng)中遷移到它的在電場(chǎng)中遷移到它的PI時(shí)，由于凈電荷為零，不再移時(shí)，由于凈電荷為零，不再移動(dòng)。如擴(kuò)散，附近的凝膠會(huì)使其荷電

12、陽(yáng)、陰極會(huì)重新吸引它動(dòng)。如擴(kuò)散，附近的凝膠會(huì)使其荷電陽(yáng)、陰極會(huì)重新吸引它回到回到pI位置。因此位置。因此Pr只能在只能在pI位置被濃縮成窄、穩(wěn)定的帶。位置被濃縮成窄、穩(wěn)定的帶。稱這種濃縮效應(yīng)為聚焦。稱這種濃縮效應(yīng)為聚焦。 只要凝膠中的只要凝膠中的pH梯度范圍足夠窄。便可將梯度范圍足夠窄。便可將pI相近的相近的Pr分分開，開，EF是電泳技術(shù)中分辨率最高的技術(shù)。是電泳技術(shù)中分辨率最高的技術(shù)。原理原理關(guān)鍵：關(guān)鍵：pH梯度的建立梯度的建立產(chǎn)生產(chǎn)生pH梯度的方法通常有兩種：梯度的方法通常有兩種： 一種是用兩種不同一種是用兩種不同pH的緩沖液互相擴(kuò)散，在混合區(qū)形成的緩沖液互相擴(kuò)散，在混合區(qū)形成pH梯度，稱

13、為梯度，稱為人工人工pH梯度梯度。但這種。但這種pH梯度不很穩(wěn)定，常用于制備梯度不很穩(wěn)定，常用于制備電泳。電泳。 另一種是利用兩性電解質(zhì)載體（另一種是利用兩性電解質(zhì)載體（Carrier ampholytes）在電）在電場(chǎng)的作用下自然形成場(chǎng)的作用下自然形成pH梯度，稱為梯度，稱為天然天然pH梯度梯度。 方法方法 理想的載體兩性電解質(zhì)的合成理想的載體兩性電解質(zhì)的合成 用具有幾個(gè)用具有幾個(gè)pH值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六胺）為原料，與不飽和酸（如丙烯酸）發(fā)生加合反應(yīng)：加胺）為原料，與不飽和酸（如丙烯酸）發(fā)生加合反應(yīng)：加合反應(yīng)優(yōu)先加在合反應(yīng)優(yōu)先加在、不飽和酸的不飽和

14、酸的碳原子上，調(diào)節(jié)胺和酸碳原子上，調(diào)節(jié)胺和酸的比例可以加上一個(gè)或多個(gè)羧基，這種合成方法與一般有的比例可以加上一個(gè)或多個(gè)羧基，這種合成方法與一般有機(jī)會(huì)合成不同，有機(jī)合成一般要求合成的產(chǎn)物愈純愈好，機(jī)會(huì)合成不同，有機(jī)合成一般要求合成的產(chǎn)物愈純愈好，而這里要求而這里要求合成出的產(chǎn)物愈復(fù)雜愈好合成出的產(chǎn)物愈復(fù)雜愈好，要有多異構(gòu)物和同，要有多異構(gòu)物和同系物，以保證的很多具有系物，以保證的很多具有不同而又互相接近的不同而又互相接近的pK值和值和pI值，從而得到平滑的值，從而得到平滑的pH梯度梯度。載體兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)。載體兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)在在pH3-10的范圍，分子量在的范圍，分子量在300-1000

15、之間。之間。等電聚焦電泳示意圖 上圖左以A，B兩種蛋白質(zhì)為例，作出它們的凈電荷曲線圖，橫軸代表環(huán)境中的pH值，縱軸代表蛋白質(zhì)的凈電荷，在pH 6.5時(shí)，A帶有兩個(gè)正電荷，B帶有一個(gè)負(fù)電荷。使A與B的凈電荷為0的pH值分別為pH9和pH5，這就是它們的等電點(diǎn)。 IEF是在具有pH梯度環(huán)境中進(jìn)行的電泳。將蛋白質(zhì)置于不同pH梯度的膠體進(jìn)行電泳，它會(huì)朝著與自身所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)，直到抵達(dá)等電點(diǎn)（pI）相同的pH值處才停止，如果它移到別的pH處，會(huì)因?yàn)閹щ姸俣纫苿?dòng)到和它pI相符的pH處。n優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：使用兩性載體電解質(zhì)，在電極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)、使用兩性載體電解質(zhì)，在電極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)、線

16、性的線性的pH梯度；梯度；由于由于“聚焦效應(yīng)聚焦效應(yīng)”，即使很小的樣品也，即使很小的樣品也能獲得清晰、鮮明的區(qū)帶界面；能獲得清晰、鮮明的區(qū)帶界面；電泳速度快；電泳速度快；分辨率分辨率高高;加入樣品的位置可任意選擇；加入樣品的位置可任意選擇；可用于測(cè)定蛋白質(zhì)類可用于測(cè)定蛋白質(zhì)類物質(zhì)的等電點(diǎn)；物質(zhì)的等電點(diǎn)；適用于中、大分子量（如蛋白質(zhì)、肽類、適用于中、大分子量（如蛋白質(zhì)、肽類、同工酶等）生物組分的分離分析。同工酶等）生物組分的分離分析。n缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：等電聚焦要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質(zhì)等電聚焦要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀；可能發(fā)生沉淀；樣品中的成分必須停留在其等電點(diǎn)處，

17、不樣品中的成分必須停留在其等電點(diǎn)處，不適用于在等電點(diǎn)不溶或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)適用于在等電點(diǎn)不溶或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)等電聚焦電泳的特點(diǎn)及應(yīng)用等電聚焦電泳的特點(diǎn)及應(yīng)用 第一向采用等電聚焦第一向采用等電聚焦 根據(jù)復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分根據(jù)復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分中各個(gè)蛋白質(zhì)的中各個(gè)蛋白質(zhì)的PIPI的不同，將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。的不同，將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。 第二向采用了十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝第二向采用了十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳膠電泳 （SDS-PAGESDS-PAGE）就是按蛋白質(zhì)分子量的大?。┚褪前吹鞍踪|(zhì)分子量的大小使其在垂直方向進(jìn)行分離。其結(jié)果不再是條帶狀，使其在垂直方向進(jìn)行分離。其結(jié)果不再是條帶狀，而是呈現(xiàn)為斑點(diǎn)狀而是呈現(xiàn)為斑點(diǎn)狀。5 5、雙向凝膠電泳（二維電泳）、雙向凝膠電泳（二維電泳）膠性 PH9中電加解入質(zhì)了溶雙液 PH3加上電場(chǎng)后建立穩(wěn)定PH梯度蛋白質(zhì)溶液加入，建立電場(chǎng)染色后，蛋白質(zhì)因PI值不同，沿PH梯度分離開第一向等電聚焦等電聚焦PI逐漸降低等電聚焦膠放在SDS聚丙烯酰胺凝膠上 第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量逐漸降低PI 逐漸降低 06-07 雙向凝膠電泳示意圖雙向凝膠電泳示意圖免疫電泳是免疫電泳是瓊脂平板電泳瓊脂平板電泳和和雙相免疫擴(kuò)散雙相免疫擴(kuò)散兩種方法的結(jié)合。兩種